南京大學化學化工學院生命分析化學國家重點實驗室黃碩課題組利用納米孔測序技術在DNA鳥嘌呤的烷基化堿基損傷檢測方法學研究中取得重要進展，于2019年4月25日在《德國應用化學》發表論文“Nanopore sequencing accurately identifies the mutagenic DNA lesion O6-carboxymethyl guanine and reveals its behavior in replication”。

細胞新陳代謝產生的內源物質（活性氧、亞硝基化合物等）和一些環境因素（UV、電離輻射等）會攻擊人類的遺傳物質DNA，造成DNA雙鏈斷裂、脫堿基以及各種修飾堿基等多種形式的化學損傷。如果沒有被正確修復，DNA損傷會對遺傳物質的準確傳遞產生負面影響，甚至引發細胞凋亡。鳥嘌呤的烷基化損傷O6-carboxymethylguanine（O6-CMG）是DNA損傷中的一種，其存在會引導DNA復制過程中的G-A堿基顛換，進而導致DNA序列的永久性改變，如原癌基因K-ras和抑癌基因p53發生的G-A基因突變。基因層面實現O6-CMG的精準定位將對靶向修復烷基化堿基損傷，建立早期腫瘤標志物等領域提供寶貴信息，具有極大的科研價值。目前對O6-CMG的檢測方法包括免疫親和液相色譜法（immunoaffinity-HPLC fluorescence assay）和液相色譜質譜聯用法（LCMS/MS）等。但這些方法需要酸化水解O6-CMG，并且對DNA鏈進行消解，從而破壞了原始序列。現有的二代測序平臺雖然能夠對于DNA序列進行測序，但卻無法對O6-CMG進行直接測序檢測。因此現階段尚未有一種方法可以實現O6-CMG在基因中的精準定位。

納米孔測序技術是新興的單分子測序方法。原理上說，納米孔測序技術可以在單分子水平直接讀取堿基序列，且無需基因擴增，是檢測修飾堿基最直接的方法。O6-CMG分子結構特殊，屬于罕見的帶有負電荷的修飾堿基，同時具有較大的分子尺寸，與所有天然堿基和大部分表觀遺傳學修飾有直接的理化性質區分。以上所述的分子結構在納米孔測序中預期會產生特異性極強的測序信號，然而對O6-CMG的納米孔測序檢測此前尚無文獻報道。

南京大學黃碩課題組和瑞士巴塞爾大學Dennis Gillingham課題組合作，利用納米孔測序技術，實現了單分子水平上的O6-CMG的高特異性檢測。該合作團隊通過設計特殊的DNA模式序列，并用化學合成的手段在模式序列的不同位置引入一個或多個O6-CMG修飾堿基，進而在納米孔測序過程中直接觀測到了O6-CMG產生的特異性測序信號。O6-CMG在納米孔測序中表現為極高的測序電流信號，與天然堿基信號顯著區分，并借此實現O6-CMG在DNA序列中的精準定位。在所展示的實驗數據中，O6-CMG的單次測序事件識別正確率可高達95%以上。三次重復測序即可達到99.9%以上的Consensus正確率。相較于傳統方法而言，該方法具有單分子檢測精度，保留了原始堿基上的官能團修飾，同時還能獲取O6-CMG周圍的堿基序列，是目前實現O6-CMG直接精準定位的唯一方法。

在進一步的實驗中，該團隊在單分子測序實驗中意外發現O6-CMG會在單分子水平對phi29 DNA聚合酶產生復制阻礙，具體表現為奇異的動力學特征，并有望借助該單分子酶動力學特征實現對一系列類似修飾堿基的深度區分，原則上可以實現對O6-CMG等一系列堿基損傷的100%精準分辨。

圖1. O6-CMG分子式及O6-CMG測序機理示意圖。左上：O6-CMG的化學結構。藍色標注為羧甲基修飾部分。右上：納米孔測序機理，納米孔最窄處為測序信號識別位點，O6-CMG在經過識別位點時，匯報測序信息。下：納米孔測序原始電流數據：紅色部分電流信號為O6-CMG所產生的特異性信號。隨著phi29 DNA聚合酶進一步延伸DNA 模板鏈，O6-CMG進入聚合酶合成位點，從電流信號觀測到O6-CMG無法被phi29 DNA聚合酶延伸，且表現為前進與后退交替進行的單分子酶動力學特征。

該工作由南京大學化學化工學院黃碩課題組和瑞士巴塞爾大學化學學院Dennis Gillingham課題組共同完成，南京大學化學化工學院17級碩士研究生王宇與瑞士巴塞爾大學化學學院博士后Kiran M. Patil為共同一作，黃碩教授與Dennis Gillingham教授為論文共同通訊作者，南京大學為第一通訊單位。

論文主要完成單位黃碩課題組主要從事單分子生物納米孔器件原創研發與醫療檢測應用。近年來，黃碩課題組在該研究領域有多項成果發表，包括開發了一種新型的納米孔錯位測序方法（nanopore-induced phase-shift sequencing, NIPSS, Chemical Science, 2019, 10(10): 3110-3117.）和新型光學納米孔技術（Osmosis-Driven Motion-Type Modulation of Biological Nanopores for Parallel Optical Nucleic Acid Sensing. ACS applied materials & interfaces, 2018, 10(9): 7788-7797.），為納米孔測序拓展更多應用出口。

此項研究得到了國家自然科學基金（項目編號：91753108、21327902、21675083）、中央高校基本科研業務費（國際科技合作促進項目）（項目編號： 020514380142、020514380174）、生命分析化學國家重點實驗室（項目編號：5431ZZXM1804、5431ZZXM1902）、江蘇省雙創計劃等經費支持。