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在復(fù)雜的異質(zhì)標(biāo)本中同時(shí)識別和定位多個(gè)分子或分子組裝體的能力長期以來一直是推動熒光顯微鏡在生物和物理科學(xué)中應(yīng)用的主要優(yōu)勢。例如，自 1986 年以來，使用四種光譜不同的熒光團(tuán)鑒定 DNA 的腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和鳥嘌呤 (ATCG) 堿基，已成為大多數(shù)自動化 DNA 測序技術(shù)的基礎(chǔ) [1]。

在下文中，小編為大家介紹了幾種多重?zé)晒鈾z測的方法及其特點(diǎn)，并展示利用虹科固態(tài)光源實(shí)現(xiàn)的多重?zé)晒饧夹g(shù)的應(yīng)用案例。

01 基于光譜鑒別的

多重?zé)晒鈾z測

目前，大多數(shù)多路檢測方案都基于光譜鑒別，因?yàn)榕c基于時(shí)間或空間鑒別的方法相比，它在技術(shù)上不太復(fù)雜且成本更低[2]。該技術(shù)原理主要利用雙分子標(biāo)記的熒光染料和熒光蛋白 (FP) 的光譜特性，如圖 1 所示。

在這個(gè)例子中，兩種熒光標(biāo)記的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜具有明顯的光譜重疊以及分離的區(qū)域。因此，可以通過特征的激光區(qū)域來實(shí)現(xiàn)不同熒光團(tuán)的激發(fā)。當(dāng)兩種熒光團(tuán)都存在時(shí)，比如利用475nm的激光可以實(shí)現(xiàn)兩種熒光團(tuán)同時(shí)倍激光。而只有在大于 550 nm 的波長下才有可能選擇性激發(fā)一種熒光團(tuán)而不激發(fā)另一種熒光團(tuán)。通過這種對比成像方式來獲取更多特征圖像。

圖 1. Alexa Fluor 488 和 Alexa Fluor 555 熒光團(tuán)的標(biāo)準(zhǔn)化熒光激發(fā)和發(fā)射光譜。發(fā)射光譜重疊區(qū)域以綠色陰影顯示。灰色陰影區(qū)域表示用于獲取圖 2 中圖像 A-C 的激發(fā)帶寬 (475/28 nm)

基于圖 1 中的兩種熒光團(tuán)的光譜位置，有研究者對麂皮成纖維細(xì)胞實(shí)現(xiàn)標(biāo)記，標(biāo)記有 Alexa Fluor 488 phalloidin（肌動蛋白）和小鼠抗 OxPhos 復(fù)合物 V + Alexa Fluor 555 山羊抗小鼠 IgG（線粒體）。

實(shí)驗(yàn)中使用虹科 SPECTRA 光源、Andor Zyla 5.5 sCMOS 相機(jī)和 Nikon Ti2 顯微鏡獲取的同一區(qū)域的四張 60X 熒光圖像，如圖2所示。圖像不會因串?dāng)_而退化，因?yàn)榧ぐl(fā)帶寬 (555/28 nm) 與 Alexa Fluor 488 的激發(fā)光譜沒有很大程度的相交，從而實(shí)現(xiàn)多路熒光檢測的效果。

圖 2. 使用單波段激發(fā)獲得的肌動蛋白細(xì)胞骨架圖像與線粒體細(xì)胞圖像然而，光譜鑒別的方法并不能適用所有場景。目前光譜鑒別的最大局限在于光譜串?dāng)_，其適用范圍僅限于大約五個(gè)目標(biāo)（如圖 1 和 2）。在上面的例子中，雖然只有兩個(gè)熒光標(biāo)記，但是它們的激發(fā)和發(fā)射波長跨越了整個(gè)可見波長范圍（ 400–700 nm）。而在當(dāng)前使用的數(shù)千種不同染料和 FP 中，熒光激發(fā)和發(fā)射的光譜帶寬幾乎沒有變化，較寬的光譜范圍限制了光譜鑒別的多重?zé)晒鈾z測技術(shù)的進(jìn)一步應(yīng)用。目前，大規(guī)模生物系統(tǒng)的基因組和轉(zhuǎn)錄組研究可能需要同時(shí)識別和定位成百上千的分子靶標(biāo)，這種高度并行的分析超出了基于光譜鑒別的多路復(fù)用的能力。盡管已經(jīng)開發(fā)出具有窄發(fā)射光譜的量子點(diǎn)納米晶體 [3]，但與有機(jī)染料相比，這種改進(jìn)的代價(jià)是熒光團(tuán)尺寸增加了一個(gè)數(shù)量級以上，這反過來又阻礙了它們在雙分子標(biāo)記應(yīng)用中的實(shí)用性 。

02 基于SPECTRA光源的

多重染色成像

由于光譜鑒別技術(shù)在多重?zé)晒鈾z測的局限性，研究者們?yōu)榱藬U(kuò)大可檢測目標(biāo)數(shù)量而引入的一些新技術(shù)。

近期，有研究者提出，提出了一種直接的方法，可以從連續(xù)的全腦切片中生成一組綜合生物標(biāo)志物的讀數(shù)，表征所有主要的腦細(xì)胞類型，范圍從亞細(xì)胞區(qū)室、單個(gè)細(xì)胞、局部多細(xì)胞生態(tài)位到每個(gè)切片的全腦區(qū)域。通過對濾光片和標(biāo)記試劑的仔細(xì)優(yōu)化，以及對原始熒光圖像數(shù)據(jù)的串?dāng)_和非特異性標(biāo)記進(jìn)行校正的穩(wěn)健解混算法的應(yīng)用，已經(jīng)證明了腦組織的 10 色多重成像 [5]。

圖3 多重 IHC 染色和多光譜廣域落射熒光成像設(shè)備[5]

該成像平臺在從紫外到近紅外（350-800?nm）的整個(gè)可用光譜范圍內(nèi)，充分利用了廣泛選擇的光譜兼容熒光團(tuán)的可用性。10 色多光譜成像所需的寬視場落射熒光顯微鏡組件包括配備高分辨率物鏡、高靈敏度數(shù)碼相機(jī)、廣譜光激發(fā)源和 10 個(gè)獨(dú)立的激發(fā)/二向色/發(fā)射濾光片組經(jīng)過優(yōu)化，可檢測多達(dá) 10 種常用或定制的光譜兼容熒光報(bào)告分子，具有最小的光譜串?dāng)_。

圖 4. SPECTRA Light Engine 的光譜輸出經(jīng)過優(yōu)化，可選擇性激發(fā)用于 10 重免疫熒光檢測的熒光染料 [5]。

圖 4顯示了針對本技術(shù)中使用的熒光染料面板的選擇性激發(fā)而優(yōu)化的虹科SPECTRA 光源 的光譜輸出。光源結(jié)合了 LED、光管和激光器，以實(shí)現(xiàn)所需的光譜激發(fā)分布和所需的光功率。使用相同的熒光染料面板和濾光片配置，可以通過連續(xù)幾輪的剝離、重新標(biāo)記和成像來增加多路復(fù)用的程度。

通過五個(gè)循環(huán)的剝離、10 色重新標(biāo)記和成像，以及專業(yè)的隔離算法與深度學(xué)習(xí)，已經(jīng)實(shí)現(xiàn)在整個(gè)大鼠腦冠狀切片中同時(shí)定位 50 個(gè)生物標(biāo)志物目標(biāo) [5]。

03 基于CELESTA光源的

MERFISH技術(shù)

通過將空間和時(shí)間維度添加到基于光譜辨別的多路復(fù)用中，已經(jīng)開發(fā)出能夠同時(shí)識別和定位成百上千個(gè)生物分子目標(biāo)的多路復(fù)用技術(shù) [6]。在相當(dāng)大的程度上，這些技術(shù)利用核酸雜交既可以識別 DNA 和 RNA 分子靶標(biāo)，也可以作為產(chǎn)生熒光染料順序排列的模板。?

圖 5. 用于基因表達(dá)分析的分子條形碼掃描原理。帶有激發(fā)和發(fā)射濾光片的掃描儀可識別由藍(lán)色、綠色、黃色和紅色圓圈表示的 4 種染料，從探針位置 1 到 6 讀取熒光信號，以揭示雜交核酸靶標(biāo)的編碼身份。基于此原理的MERFISH（多重誤差魯棒熒光原位雜交）技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模多重單分子成像，能夠同時(shí)測量單細(xì)胞中成百上千個(gè)目標(biāo) RNA 的拷貝數(shù)和空間分布 [9]。在 MERFISH 中，目標(biāo)相關(guān)的條形碼被迭代讀取。首先，編碼寡核苷酸探針與目標(biāo) RNA 雜交。然后連續(xù)添加熒光染料標(biāo)記的讀出寡核苷酸探針，在單分子水平上進(jìn)行空間定位，然后熄滅。讀出探針必須專門與編碼探針雜交，而不是與細(xì)胞核酸雜交。編碼探針身份在連續(xù)成像周期中累積，如果通過讀出探針的雜交檢測到編碼探針，則分配二進(jìn)制位值“1”，否則分配“0”值。通過在每個(gè)循環(huán)中同時(shí)檢測具有光譜不同熒光標(biāo)記的讀出探針，可以減少雜交 + 成像循環(huán)的數(shù)量，從而減少完成數(shù)據(jù)采集所需的時(shí)間。圖 5. CELESTA 激光引擎光譜輸出針對 MERFISH 多路復(fù)用單分子成像進(jìn)行了優(yōu)化。

MERFISH 需要與典型 sCMOS 相機(jī)傳感器的尺寸 (~200 mm2) 相匹配的高強(qiáng)度、空間均勻的照明場。為了滿足這一要求，研究者們在顯微鏡中安裝了一個(gè)與虹科 CELESTA 光源（圖 5）的光纖輸出耦合的專用臨界落射器，通過具有高數(shù)值孔徑的高放大倍率物鏡在樣品平面上提供每平方厘米1-10W的光強(qiáng)度。

顯然，高度平行的熒光標(biāo)記生物分析，那些需要多路復(fù)用超過簡單光譜辨別能力的分析，可以通過明智地選擇熒光、濾光片、微調(diào)激發(fā)照明和智能算法來實(shí)現(xiàn)。分子條形碼等巧妙的標(biāo)記策略也可用于各種生物樣品，以增強(qiáng)來自高度復(fù)雜組織標(biāo)本的生物分子信息的光譜辨別和空間分布。

在虹科固態(tài)光源的純凈、明亮、穩(wěn)定的照明性能的支持下，能夠有效克服可見波長內(nèi)定義的歷史限制，能夠?qū)崿F(xiàn)最高通量、最優(yōu)質(zhì)量的多路復(fù)用熒光檢測效果。

虹科固態(tài)光源介紹

虹科SPECTRA

虹科SPECTRA固態(tài)光源擁有8個(gè)可單獨(dú)控制的固態(tài)光源，提供了空前的性能。每個(gè)色帶在液體光導(dǎo)的末端提供大約半瓦的光功率。組成光源包括LED，專利的冷光燈和激光光源。

光源的輸出通過內(nèi)部集成的帶通濾光片優(yōu)化。光輸出端口具有內(nèi)置適配器，可通過標(biāo)準(zhǔn)的3mm直徑的液態(tài)光導(dǎo)LLG連接到顯微鏡和其他生物分析儀器。為滿足需要快速（10us）切換的應(yīng)用，所有八個(gè)信號源均提供了TTL觸發(fā)輸入。

虹科CELESTA

虹科 CELESTA 和 CELESTA quattro 光源包括4-7個(gè)可單獨(dú)控制的固態(tài)激光光源陣列（在400-800nm范圍提供7個(gè)可選波長），并且支持快速切換。CELESTA 光引擎在1.5mm直徑光纖的遠(yuǎn)端出光，其7個(gè)激光器中的每一個(gè)都能提供約1W的輸出功率。

同樣，CELESTA quattro 光源以相同的輸出功率規(guī)格提供了一個(gè)具有性價(jià)比的4或5線選擇。激光輸出與復(fù)雜的控制和監(jiān)測系統(tǒng)相結(jié)合，為旋轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡、空間分辨率轉(zhuǎn)錄組學(xué)和其它高級成像應(yīng)用提供所需的高清晰度性能。