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談到顯微成像系統，常常會用分辨率來評價成像能力的高低，那分辨率到底指的是什么，又怎樣計算呢？其實對于一個特定的顯微成像系統，分辨率要從兩個方面來考慮，一種是光學系統的分辨率—光學衍射極限，另一種就是成像探測器的圖像分辨率，兩個概念缺一不可，下面將對這兩種分辨率及其對成像結果的影響進行詳細說明。

1、相機的圖像分辨率

我們在購買相機的時候，常常會說這個相機的分辨率是500萬，800萬，或者4k2k，這里說的分辨率，其實指的是成像探測器的圖像分辨率，就是探測器芯片上的總像素數量。

探測器芯片的另一個非常重要的指標就是像元大小，對于sCMOS探測器來說，一個像素的大小通常是在幾個um。以科研級熒光顯微鏡通常使用的Hamamatsu Flash 4.0 sCMOS探測器為例，像素尺寸為6.5um，相機分辨率是2048x2048，如果顯微鏡的總放大倍數為10倍，那么1um的物經光學系統放大為10um的像，這樣的像會由10um/6.5um=1.54個像素來顯示，用實際物體來理解，圖像中的一個像素點表示的實際距離為650nm，像元尺寸越小，圖像分辨率越高。

相機的圖像分辨率=2*像素大小/放大倍數，則對上面的例子來說，相機的圖像分辨率=2*6.5um/10=1.3um。

2、光學衍射極限

這里簡單介紹下什么是“普通熒光顯微鏡的分辨率”—光學衍射極限(Abbe diffractionlimit)。

圖. 光學衍射極限示意圖

如上面的簡圖所示，黑色箭頭表示的物體 AB 經過物鏡等之后在相機上成像。由于光的衍射，物體上的點如A、B，在相機上并不是單獨的點，而是一個個有一定大小的斑，被稱為夫瑯禾費衍射斑，如右側的同心圓所示。根據光學中的瑞利判據，1873 年，德國物理學家恩斯特·阿貝（Ernst Abbe）推算出，顯微鏡能分辨的物體上兩點 A、B 的最小距離 h 為：波長/(2*N.A.)。

這個公式就是光學顯微鏡的分辨率公式，或稱為光學衍射極限。（注意此處的分辨率與通常說的顯示器分辨率含義不同）其中，為光的波長，n為物方的折射率，θ為物體與物鏡邊緣連線和光軸的夾角。也常稱為數值孔徑，簡寫為NA。

目前常用的高倍物鏡NA為 1.49，所以對于可見光，比如波長 500 納米的綠光，計算得到顯微鏡的分辨率約為 200 納米。因此可知，即使再提高物鏡的放大倍率，也不能提高顯微鏡的分辨率。而 200 納米這個數值也就通常被人稱作衍射極限。如上圖中（a）（b）（c）所示，當兩個點逐漸靠近到一個程度時，我們就很難分辨該光斑是一個點還是兩個點疊加在一起了（如圖（c）），更別提其空間/立體位置關系了。

3、顯微成像系統的分辨率

了解了上面兩種分辨率的原理，那已知一個顯微成像系統的參數，就可以計算出這個系統的分辨率究竟是多少了。

例如：一臺生物顯微鏡，使用的物鏡為放大倍數20倍，N.A.=0.4，光路中沒有其他放大，使用的相機為Hamamatsu Flash 4.0 sCMOS，像素尺寸6.5um。探測的熒光波長按550nm計算。

系統的光學分辨率=550nm/(2*0.4)=688nm

系統探測器的圖像分辨率=2*6.5um/20=650nm

比較兩者，光學分辨率較差，所以對于這臺顯微成像系統，xy方向分辨率為688nm。

當然，談到顯微成像系統，就離不開對樣品的討論，生物樣品特定結構的染色密度同樣會對最終的成像分辨率有決定性的影響，這里由于篇幅原因就不對這方面做具體的展開，后續文章中會對染料及染色密度對熒光顯微成像系統，特別是超分辨率成像系統的分辨率影響做具體的介紹。

審核編輯：湯梓紅