北京大學(xué)信息科學(xué)技術(shù)學(xué)院、區(qū)域光纖通信網(wǎng)與新型光通信系統(tǒng)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室王愛民副教授課題組與分子醫(yī)學(xué)研究所陳良怡教授課題組合作發(fā)明了一種基于貝賽爾光束的新型三光子顯微鏡（Bessel-Beam three-photon microscopy）。此顯微鏡成功實(shí)現(xiàn)針對(duì)稀疏標(biāo)記的樣本進(jìn)行快速深層活體三維腦成像的研究。利用光學(xué)成像技術(shù)在活體上觀察組織和細(xì)胞內(nèi)的動(dòng)態(tài)過程，是研究生物醫(yī)學(xué)問題的關(guān)鍵手段之一。三光子顯微鏡，對(duì)常用綠色及紅色熒光蛋白的激發(fā)波長(zhǎng)與雙光子相比更長(zhǎng)，且正好處于生物組織的最佳紅外通光窗口（1.3 μm和1.7 μm），具有更好的光學(xué)穿透效果；此外，作為更高階的非線性效應(yīng)，三光子顯微成像相比雙光子能明顯提高信號(hào)背景比。目前，三光子可以在實(shí)現(xiàn)組織1.7 mm深度左右的無損高分辨率成像，從而觀察小鼠大腦皮層下的海馬區(qū)的結(jié)構(gòu)和功能。

多光子顯微系統(tǒng)一般采用“點(diǎn)掃描”的方式進(jìn)行成像，本身極大限制了其三維體成像速度。尤其針對(duì)三光子來說，激發(fā)脈沖的重復(fù)頻率通常在2 MHz以內(nèi)，若考慮20 μm厚的樣本（512×像素點(diǎn)512像素點(diǎn)，2 μm 的z軸間隔），其體成像速度被限制在0.7 Hz，無法實(shí)時(shí)同步觀察成百上千個(gè)神經(jīng)元群中的動(dòng)態(tài)信號(hào)過程。本工作使用z軸方向拉伸的貝賽爾光進(jìn)行“光柱掃描”成像，針對(duì)稀疏標(biāo)記生物樣本的三光子三維體成像的速度可以提高10倍或更高，從而更清楚地解析大腦神經(jīng)信號(hào)處理中的四維時(shí)空過程。貝賽爾光方法雖然已于雙光子顯微成像中得到應(yīng)用，但其旁瓣效應(yīng)大大降低成像質(zhì)量。由于三光子激發(fā)為更高階的非線性效應(yīng)，旁瓣效應(yīng)得到有效抑制， 貝賽爾光與三光子成像相結(jié)合可將兩者的優(yōu)勢(shì)獲得最大的發(fā)揮。

成像不僅僅比雙光子更深，即使是同樣深度的情況下也可以得到比雙光子貝賽爾顯微鏡更高分辨率和對(duì)比度的熒光圖像。研發(fā)團(tuán)隊(duì)在果蠅、斑馬魚及小鼠大腦上充分證實(shí)了利用這一成像技術(shù)的優(yōu)勢(shì)。

小鼠腦海馬神經(jīng)元三光子顯微熒光成像，其中：圖a，深度為620～680 μm神經(jīng)元鈣熒光活動(dòng)在貝賽爾光柱模式下可被同時(shí)記錄；圖b，相應(yīng)體積內(nèi)神經(jīng)元活動(dòng)的高斯光成像（貝賽爾光模式、高斯光模式的成像時(shí)間分別為1 s和60 s）

近日，上述成果以《快速體成像貝賽爾光束三光子顯微鏡》（Rapid volumetric imaging with Bessel-Beam three-photon microscopy）為題，在線發(fā)表于《生物醫(yī)學(xué)光學(xué)快報(bào)》（Biomedical Optics Express）；并列第一作者為信息學(xué)院2014級(jí)博士研究生陳冰影和分子醫(yī)學(xué)所2013級(jí)博士研究生黃小帥，王愛民和陳良怡為共同通訊作者。相關(guān)工作得到國(guó)家重大科研儀器設(shè)備研制專項(xiàng)資助。這也是該項(xiàng)目組繼成功研制雙光子光片顯微鏡（高速活體）、2.2 g微型化雙光子顯微鏡（活體可佩帶）、超分辨顯微鏡（高分辨活體）之后，在突破活體生物成像深度方面取得的重要研究成果。