繼上篇結(jié)尾：

——Roukes將其比作功能磁共振成像（fMRI），一種目前用于對整個大腦進行成像的類似技術(shù)。他說："fMRI掃描中的每個體素，或三維像素，通常約為一立方毫米的體積，包含大約10萬個神經(jīng)元。因此，每個體素代表了所有這10萬個細(xì)胞的平均代謝活動。綜合神經(jīng)光子學(xué)的首要目標(biāo)是實時記錄這10萬個神經(jīng)元集合中的每個神經(jīng)元正在做什么。

高分辨率

High Resolution

這意味著研究人員現(xiàn)在可以在高度散射的神經(jīng)組織中實現(xiàn)神經(jīng)元活動的密集功能成像，在任意深度提供細(xì)胞尺度的分辨率。

Caltech高級研究科學(xué)家Moreaux說："我們的方法是通過在三維空間晶格上分布密集的微尺度光子發(fā)射器和探測器像素陣列，從而于在大腦中植入整個無透鏡的成像系統(tǒng)。這些像素陣列被集成到狹窄的硅柄上，結(jié)合了硅納米探針制造的最新發(fā)展結(jié)果。配合功能性分子報告器和光遺傳驅(qū)動器，這種新型裝置展現(xiàn)了訊問小鼠大腦皮層的10萬個神經(jīng)元的所有神經(jīng)活動的前景。

Roukes表示，該團隊的長期目標(biāo)是傳播集成神經(jīng)光子學(xué)的先進儀器，以實現(xiàn)多機構(gòu)合作，利用這種新技術(shù)開拓先進的神經(jīng)科學(xué)研究。以前，這種神經(jīng)技術(shù)的開發(fā)主要依靠單個實驗室或調(diào)查員領(lǐng)導(dǎo)的研究。

大腦計劃背后的團隊走到一起，為神經(jīng)科學(xué)研究帶來了大規(guī)模的合作，以前的物理科學(xué)中也是如此的。Roukes說，現(xiàn)在，綜合神經(jīng)光子學(xué)為這種儀器建設(shè)團隊合作開了一扇門。他說："許多構(gòu)建模塊已經(jīng)存在了十年或更久。但是，直到最近，還沒有人有這樣的眼光、意愿和資金來把它們放在一起，實現(xiàn)這些強大的神經(jīng)科學(xué)工具。

例如，就如Moreaux所說，為了使神經(jīng)光子探針的光發(fā)射器在組織內(nèi)進行微光束傳輸，研究人員必須促進從現(xiàn)有的紅外光子學(xué)電路范式（廣泛用于電信應(yīng)用）向可見光子學(xué)電路的轉(zhuǎn)變。"更具體地說，用藍光，以適配熒光生物標(biāo)志物的激發(fā)光學(xué)光譜。我們在加州理工學(xué)院的Kalvi Nanoscience Institute（KNI）的潔凈室開展了這項工作，并與我們在法國Leti-CEA和新加坡AMF的合作伙伴一起推進。"當(dāng)然，開發(fā)由紅外線激活的光遺傳執(zhí)行器，這種"反向"努力也為使用紅外線光子學(xué)電路提供了進一步的可能性。值得注意的是，近紅外光遺傳執(zhí)行器的開發(fā)近來發(fā)展勢頭很好。

突破

Breakthrough

最近，在分子報告器方面的一些突破可以實現(xiàn)多模式和多物理感應(yīng)。同樣，光遺傳執(zhí)行器能夠?qū)ι窠?jīng)活動進行光學(xué)控制，以及通過基因編碼影響傳遞分子報告器和提供細(xì)胞類型特異性的執(zhí)行器的。

在挑戰(zhàn)方面，特別是涉及到硬件時，Moreaux覺得一個關(guān)鍵的技術(shù)挑戰(zhàn)是將光傳輸和光子傳感器整合在同一芯片上，并采用可植入的形狀因素（硅柄）。'換句話說，就是一種既能傳遞圖案化的脈沖光又能進行光子檢測的集成技術(shù)，如CMOS和光子學(xué)電路（硝酸硅）的集成。

如果該技術(shù)要被廣泛采用，該技術(shù)的大規(guī)模生產(chǎn)能力將是至關(guān)重要的。因此，Moreaux說，另一個挑戰(zhàn)是，這種集成能力不僅必須在小規(guī)模的概念驗證中實現(xiàn)，而且還必須在代工規(guī)模上實現(xiàn)。此外，由于集成神經(jīng)光子學(xué)使用光來引導(dǎo)神經(jīng)元活動的電信號，如果該技術(shù)要用于繪制大腦電路和其他應(yīng)用，光學(xué)報告器方面的開發(fā)也是至關(guān)重要的。

莫羅說："雖然在過去十年中，光遺傳報告器(熒光團)領(lǐng)域肯定有很多進展，但為了在綜合神經(jīng)光子學(xué)的背景下優(yōu)化其使用，有一些挑戰(zhàn)需要考慮。例如，對報告器表達的空間密度進行更精細(xì)的控制：密度太高，你就失去了分離神經(jīng)元的能力，密度不夠，你就無法充分利用該技術(shù)。

當(dāng)然，除了技術(shù)上的挑戰(zhàn)，開發(fā)這種類型的技術(shù)所需的投資也是一個巨大的障礙。莫羅說："對這種類型的投資的買入，更有可能在有更大機會獲得更大的實際投資回報的領(lǐng)域獲得驅(qū)動力，例如在臨床領(lǐng)域。

盡管有這樣一些挑戰(zhàn)，Moreaux認(rèn)為該方法是可計量的。他說："我們可以鋪設(shè)多個模塊，以密集地覆蓋大腦深處的擴展區(qū)域。我們預(yù)計，這將最終允許訊問--在大腦的任意位置和深度同時記錄和模式化刺激數(shù)百萬個神經(jīng)元--以單細(xì)胞的分辨率和細(xì)胞類型的特異性來揭示神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的動態(tài)。

莫羅說，通過與代工伙伴的合作，人們實現(xiàn)了在如可見光波長集成納米光子學(xué)的低損耗晶圓級的大規(guī)模生產(chǎn)過程上的歷史性突破。這反過來又允許在腦組織中演示相干光束的形成；實現(xiàn)微發(fā)射器的光束穩(wěn)定相位陣列的構(gòu)成和微發(fā)射器探針陣列的選擇性平面照明；以及創(chuàng)建可植入的、角度可選擇的單光子微探測器陣列。

莫羅說："這些構(gòu)成了具有微觀尺寸的完整植入式可見光波長功能成像系統(tǒng)的基本構(gòu)件。此外，我們通過開發(fā)和實施計算方法來評估散射介質(zhì)中的熒光光子產(chǎn)量，驗證了集成光子學(xué)范式的基礎(chǔ)物理學(xué)。有了這些工具，我們已經(jīng)驗證了我們的計算方法，以進行光源分離和定位，從而能夠確定實用的、可實現(xiàn)的架構(gòu)，能夠在深度上實現(xiàn)密集的體積活動重建。

這些系統(tǒng)是基于現(xiàn)有電子和光子芯片代工廠已經(jīng)常規(guī)應(yīng)用的大規(guī)模生產(chǎn)過程。莫羅認(rèn)為，像這樣的行業(yè)伙伴關(guān)系，對于使這項工作成為商業(yè)現(xiàn)實至關(guān)重要。他解釋說："與混合光子學(xué)和CMOS制造技術(shù)代工伙伴的合作，對于共同整合植入式硅柄上的不同技術(shù)功能塊將是非常重要的。同樣，擁有后處理和光電封裝專業(yè)知識的行業(yè)伙伴也是如此。我們已經(jīng)與CEA-Leti和AMF，以及IBM和臺積電在CMOS芯片制造方面進行了合作。

研究小組認(rèn)為，所有這些發(fā)展和行業(yè)的伙伴關(guān)系共同驗證了集成神經(jīng)光子學(xué)的潛力。

虹科伙伴之聲

Lumencor Insights

虹科伙伴Lumencor的技術(shù)工程師Iain Johnson就過去15年里發(fā)展的光遺傳學(xué)技術(shù)表達了看法，這些技術(shù)是神經(jīng)科學(xué)家們稱手的工具，提供神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)以功能復(fù)雜性的光譜和空間分辨率數(shù)據(jù)，同時避免使用歷史上無處不在的微電極進行直接的物理訊問。光遺傳學(xué)使用非破壞性的照明來處理細(xì)胞和細(xì)胞功能，而不是使用侵入性電極。遺傳學(xué) "指的是光激活離子通道蛋白的轉(zhuǎn)基因表達，需要將光輸入轉(zhuǎn)變成感興趣的細(xì)胞中的電活動。

圖1：示波器記錄了由Spectra X光引擎的TTL觸發(fā)產(chǎn)生的485nm（0.5ms脈寬）和560nm（3ms脈寬）交替輸出脈沖。兩個疊加的示波器軌跡顯示，其中485nm的強度通過RS232串行命令從100%調(diào)整到55%，而560nm的強度保持不變。485nm和560nm脈沖的時間間隔是~0.25ms

虹科Spectra X光引擎

用于光遺傳學(xué)刺激的照明源必須在光譜、空間和時間輸出特性方面滿足某些要求。本文考慮的這些特性與基于固態(tài)LED和激光的光引擎的性能有關(guān)。

光遺傳學(xué)主要的光譜輸出要求是光引擎的光譜輸出與可光激活的離子通道蛋白的作用光譜的最大交集。目前，最常用的光譜輸出是475nm，用于刺激channelrhodopsin（ChR2），575nm用于抑制halorhodopsin（NpHR）。基于LED的光引擎提供的光譜輸出在時間上是不連續(xù)的（圖1），但在空間上是重合的。額外的光譜輸出有利于使用新的光蛋白，并為熒光標(biāo)記和電壓敏感的染料提供激發(fā)，與光遺傳刺激或抑制并行：例如，1. 通過使用近紅外（>700nm）光刺激，可以達到更深的組織滲透。2. 通常的做法是使用黃色熒光蛋白（YFP）的共同表達，以便通過熒光顯微鏡確定ChR2的位置。3. 選擇YFP是因為它的熒光激發(fā)（510nm）與ChR2的光刺激（475nm）有足夠的波長間隔，這兩個過程可以獨立啟動。

對于大腦切片或培養(yǎng)的神經(jīng)元制劑的體外實驗，基于LED的光引擎與熒光顯微鏡相配合，提供了適合同時刺激數(shù)千個神經(jīng)元的寬場照明。對于ChR2的刺激，在樣品平面上需要1mW/mm2的輻照度閾值，這個水平是用于傳統(tǒng)熒光顯微鏡的低端范圍。空間選擇性的照明可以通過添加數(shù)字微鏡設(shè)備(DMD)來產(chǎn)生。

對于單個細(xì)胞的選擇性刺激，需要能聚焦到衍射有限的光斑尺寸<10μm的激光器。體內(nèi)實驗提供了額外的能力來觀察光遺傳刺激引起的復(fù)雜行為結(jié)果。光通常通過直徑為200μm的多模光纖傳輸，連接到植入動物大腦的插管上。與LED相比，激光在這些光纖中具有更好的耦合效率，因此是體內(nèi)光遺傳學(xué)的首選光源。

神經(jīng)元的電活動是在毫秒級的時間范圍內(nèi)被調(diào)制的。因此，用于光遺傳學(xué)刺激的照明源必須具有相同時間尺度的光學(xué)調(diào)制能力（圖1）。Kubota和同事最近發(fā)表的一篇文章充分利用了虹科Spectra X光引擎提供的時間和輸出功率控制，對表達ChR2的大鼠背根神經(jīng)節(jié)（DRG）神經(jīng)元進行了光刺激。記錄了恒定強度下不同的光脈沖持續(xù)時間（0.1至10ms）和恒定脈沖寬度下不同的刺激強度（2至78mW）的影響。

此外，用一對0.5ms的脈沖隔開5至20ms的不同間隔進行刺激，以評估ChR2脫敏的效果。

總的來說，光遺傳學(xué)和傳統(tǒng)電刺激的定量比較結(jié)合，為以前不熟悉光遺傳學(xué)技術(shù)能力的讀者提供了一個有用的參考點。

什么是熒光分子報告器（Fluorescent molecule reporter）

又稱熒光蛋白/報告分子，為測量單個細(xì)胞或細(xì)胞群的基因表達的工具。；如GFP, CFP, YFP, mCherry...

什么是光遺傳學(xué)執(zhí)行器（Optogenetic actuator）

一種可改變細(xì)胞活動的蛋白質(zhì)。當(dāng)暴露于光照時，其就會表達。這些致動器可以用來誘導(dǎo)單個或多個動作電位（可以組織成有規(guī)律的尖峰序列，也可以以用戶控制的速度進行偽隨機），抑制神經(jīng)活動，或修改生化信號通路，對事件的時間進行毫秒級控制。如ChR2, IC1C2, eNpHR等