雙光子吸收效應在量子光學領域是一個歷史悠久的理論，1931年由Maria G?ppert-Mayer在她的博士論文中提出。直到1990年底，鎖模激光器的出現才通過實驗驗證雙光子吸收現象。

在這一時期，康奈爾大學Webb實驗室是第一個使用雙光子顯微成像技術來觀察活細胞中的染色體；1994年從這個實驗室出來的德國科學家Winfried Denk最早將雙光子技術應用在神經科學領域。

之后，美國科學家Karel Svoboda在1997年成功用雙光子成像觀察了小鼠腦中的神經細胞。時至今日，雙光子顯微系統在神經科學領域有了極大的發展，近年來，光遺傳光刺激也更多地和雙光子技術結合，廣泛地應用于清醒小動物。

在傳統激光共聚焦顯微鏡中，光通過處的所有樣品都被激發，所以必須用孔徑光闌來選取焦點處樣品發出的熒光。孔徑光闌不僅遮擋了焦點以外樣品發出的熒光，而且也遮擋了焦點處散射和漫反射的熒光。

多光子顯微鏡常稱作非線性、雙光子激光掃描顯微鏡，是建立在先進的超快脈沖激光掃描技術基礎上的顯微鏡實驗方法，在更深入的層面上提供了更優秀的光學切片能力。

熒光分子同時吸收兩個長波長的光子到激發態，在經過一個很短的所謂激發態壽命的時間后，發射出一個波長大于激發光波長一半的較短的光子，從而實現成像。

這種技術需要超快激光器，由于其具有非常高的峰值功率和較低的平均功率，從而可以減小或者消除光漂白和光毒作用。多光子的吸收現象是非線性效應，只發生在聚焦焦點處，不需要共聚焦孔徑光闌濾光，從而大大提高成像亮度和信噪比。

在過去的二十年中，鈦：藍寶石激光器是許多機構多光子應用的主力光源。因為他們提供的波長可調諧，具有非常高的飛秒激光脈沖輸出功率。

由于鈦：藍寶石激光器具有極其復雜和極具挑戰的調試校準過程，現在鎖模的光纖飛秒激光器在多光子顯微鏡中成為極具吸引力的光源。Toptica的光纖飛秒激光器可提供廣泛的波長選擇方案，這些激光具有非常高的脈沖峰值功率和較低的平均功率，在持續運轉上不需要額外的維護和任何水冷設備。另外，我們采用的SAM被動鎖模，具有優秀的模式穩定性和更高的性價比。

Toptica的FemtoFiber Pro型號從一個孔徑發射亞100fs 脈沖，輸出波長780nm（>100mW）和 1030nm（>200mW），可獨立調制強度、脈寬（啁啾）以及相應的脈沖間延遲，這些可調節的參數在活體細胞多色雙光子成像、寬帶相干反斯托克斯拉曼光譜（CARS）、受激拉曼光譜（SRS）研究，以及泵浦-探測實驗和脈沖受激發射耗盡（STED）顯微應用中，能夠大顯身手。我們的飛秒光纖激光器可提供波長在1μM以上的激光，這些激發光束受散射影響較小更容易穿透標本，對活性標本的殺傷極小，因此非常適用于活細胞成像，尤其是厚的活組織如腦片、胚胎、整個器官甚至整個機體的成像研究。

Toptica光纖激光器將來會成為多光子等先進的顯微技術的主力，如雙光子、寬帶拉曼和其他時間分辨的應用等。光纖激光器具體參數如下圖：

應用示例：

雙光子成像系統簡圖

受體神經元軸突，使用鈦：藍寶石激光器和我們的光纖飛秒激光器FemtoFiber pro NIR的雙光子成像對比圖

海馬體回CA1錐體神經元使用Fluo-4和Alexa 594標記試劑填(~50 μm 深)，使用FemtoFiber pro NIR和Femtonics Femto2D顯微鏡成像，目標后孔的平均功率為10mW。