公式

當相機工作在光子散粒噪聲（Shot Noise）限制區時。

相機拍到的圖像，亮度是以灰度值（ADU）為單位的，我們可以用圖像分析軟件計算出感興趣區（ROI）的平均灰度值 Mean-ADU 和標準差 SD-ADU （即以 ADU 為單位的噪聲）。

以上公式①變為。

這樣，我們就可以計算出。

以上計算中，圖像的標準差即代表噪聲的前提是，圖像區域內沒有任何樣品結構造成的亮度變化，否則標準差還應包含這個結構信息。為此，可以連續拍攝兩張同樣場景的圖像，然后把兩張圖像相減。相減后的圖像就只包含光子散粒噪聲了。如果以 SD-subtract 代表差值圖像的標準差，SD-image1和SD-image2代表單張圖像的標準差，則以下公式成立。

因為兩張圖像設置完全相同，SD-image1 = SD-image2，所以。

那么，以上公式最后變為。

這樣算出的 Gain 單位為 e–/ADU。

拍攝

通過公式⑤，我們知道只需要拍攝3張圖像，就可以計算出 Gain 了。

1.拍攝一張短曝光時間的黑圖像（bias 圖像）以計算offset。對同一臺相機，偏置（offset）是一個常數，在相機完全無信號的情況下，將曝光時間設為0，拍攝一幀圖像。

2.拍攝兩張平均亮度大概在相機動態范圍中間區域的圖像。如果相機是12bit的，有4096 灰度級，那么圖像的平均亮度最好在 2000 左右。這個可以通過調整曝光時間，或照明光強度來實現。基本要求是圖像上不能有接近飽和（＞4000 ADU，此時相機失去了線性度），或太暗（ 《200ADU，此時相機沒有工作在光子信號限制區，我們計算的條件不滿足）的區域。如果您的相機是 14bit 的，那么灰度級是16384，上面的值需要按比例進行調整。

計算

1. 首先在 Image J 中打開 bias 圖像，用 Analyze》measure，得到圖像的 mean 值即為 Offset。

2. 接下來，打開另外兩張圖片，選擇 Analyze 》 Measure 得到兩張圖片的平均灰度值，然后再用 Analyze 》 Summarize 就可以得到平均值 Mean-Image1， Image2。

3. 計算差異圖像的標準差：選擇 Analyze 》 Image Calculator，將兩張圖片進行 subtract，并勾選 32-bit （float） result，得到兩張圖片的差值圖像。

選擇 Analyze 》 Measure 即可看到差值圖像的標準差 SD-substarct。

4. 然后代入前面的公式⑤，就可以算出系統增益，這里需注意減去偏置值。

也可以設置不同的曝光時間，重復上述步驟，用多次測量所得的值作圖，通過擬合曲線來觀察增益的線性度。

Gain

1.CCD/CMOS相機的Gain是出廠設置好的，不會改變；

2.EMCCD的EM Gain會隨著使用老化衰減，正常使用7~10年左右，每隔一段時間應校準一次；

3.根據廠家不同，Gain 有多種表示方式。有些相機只有一個Gain，有些有三個Gain，有些連續可調（如0.5x-20x），或ISO100–ISO1200等等。以上測試，只對應當時設定的那個Gain有效。如果實際使用時，因為樣品或成像方式變化，需要改變Gain的設置，對每個Gain都需要測量。建議在保存圖像時，在文件名上反映出Gain的設置；

4.同一臺相機，Gain的倍數越大，相機的滿阱容量越小（更早飽和）；

5.同一臺相機，在軟件中調節Gain的設置，圖像亮度會變化，但實際探測到的電子數不變，因此信噪比變化不大；

6.Binning不影響Gain。

審核編輯 ：李倩