近日，來自西南大學(xué)前沿交叉學(xué)科研究院生物學(xué)研究中心的夏慶友教授、林平研究員與陸軍軍醫(yī)大學(xué)陸軍特色醫(yī)學(xué)中心蔣建新院士、吳敏研究員合作在期刊Trends in Biotechnology上發(fā)表了題為“CRISPR-Cas-mediated diagnostics”的前瞻性綜述論文，全面系統(tǒng)總結(jié)了基于CRISPR-Cas技術(shù)的體外分子診斷研究取得的最新進(jìn)展，詳細(xì)歸納了CRISPR診斷技術(shù)在不同領(lǐng)域的優(yōu)勢，討論了CRISPR-Cas技術(shù)在未來臨床診斷中面臨的重大挑戰(zhàn)和問題及解決措施，并提出了“以實現(xiàn)CRISPR診斷技術(shù)自動化和一體化為紐帶聯(lián)系病患和醫(yī)院構(gòu)建診療網(wǎng)絡(luò)”這一前瞻性策略。

CRISPR-Cas系統(tǒng)是細(xì)菌和古細(xì)菌內(nèi)類人體免疫防御系統(tǒng)，靶向切割外源遺傳物質(zhì)（DNA或RNA），實現(xiàn)抵抗外源病毒入侵。利用這一特點，將CRISPR-Cas系統(tǒng)開發(fā)為一種簡單、快速、經(jīng)濟(jì)有效和精確的基因編輯技術(shù)，使基因診斷、病原防御和疾病治療發(fā)生了革命性的變化。

傳統(tǒng)診斷技術(shù)難以滿足需求

傳統(tǒng)PCR檢測技術(shù)是診斷各種傳染性疾病的主要手段。然而，以新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）引發(fā)的新冠肺炎為例，基于PCR檢測技術(shù)的花費(fèi)的時間為4-6小時，且檢測成本昂貴，依賴大型設(shè)備，使得在偏遠(yuǎn)地區(qū)的醫(yī)療點難以開展檢測工作，同時存在感染早期呈現(xiàn)假陰性的等問題。基于抗原-抗體反應(yīng)的檢測方法，如免疫熒光法、ELISA、免疫組化等技術(shù)，檢測呼吸道分泌物中的SARS-CoV-2抗原或血清抗體，同樣是SARS-CoV-2感染診斷或治療監(jiān)測的輔助手段。但是免疫學(xué)檢測抗原或抗體存在交叉反應(yīng)、檢測窗口期較長、假陽性率高等許多缺陷。在新冠疫情仍然全球大流行的背景下，如何有效快速診斷新型冠狀病毒感染者，降低傳染率和死亡率是目前亟待解決的問題。基于CRISPR-Cas系統(tǒng)的新一代基因編輯技術(shù)以其快速、便攜、經(jīng)濟(jì)、高效的特點，為SARS-CoV-2的快速分子診斷提供了解決方案，可實現(xiàn)及早地追蹤和隔離被感染者，快速阻斷病毒傳播。論文對基于以CRISPR-Cas為基礎(chǔ)的新興診斷技術(shù)為病原微生物感染、癌癥等早期預(yù)防、分子診斷與治療監(jiān)測的研究及其最新成果進(jìn)行簡述。

CRISPR診斷技術(shù)的獨特優(yōu)勢和不足

CRISPR-Cas系統(tǒng)由gRNA和Cas蛋白組成，現(xiàn)已經(jīng)建立了基于Cas效應(yīng)器（Cas9、Cas12、Cas13）的分子診斷體系（圖1）。主要通過采用等溫擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增病原體的核酸序列，從而使CRISPR診斷方法的檢測速度超過傳統(tǒng)PCR，而且不依賴于樣本轉(zhuǎn)運(yùn)、人員和大型PCR設(shè)備。CRISPR蛋白復(fù)合物對目標(biāo)序列的準(zhǔn)確識別確保了CRISPR系統(tǒng)的高靈敏度；隨后通過工具酶（例如Csm6）放大檢測信號、串聯(lián)使用gRNA以及引入微流控系統(tǒng)，將CRISPR系統(tǒng)的靈敏度提升至與PCR相似的水平。此外，CRISPR檢測方法本質(zhì)上是試劑和樣品在一般條件下的混合反應(yīng)，使得CRISPR診斷技術(shù)具備快速、靈敏、廉價、便攜、易操作的五大優(yōu)勢。

圖1 CRISPR診斷技術(shù)的流程圖：主要由樣本處理、預(yù)擴(kuò)增、CRISPR檢測和結(jié)果讀數(shù)四部分組成

目前，Cas9蛋白介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)研究最為成熟，容易與其他技術(shù)進(jìn)行結(jié)合。Cas9介導(dǎo)的診斷體系主要是將Cas9蛋白作為一個檢測探頭與其他新興技術(shù)結(jié)合來提高檢測靈敏度或者衍生出檢測速度更快、成本更低的新方法，包括CAS-EXPAR技術(shù)、NASBACC技術(shù)、Cas9nAR、CASLFA等。而Cas12和Cas13蛋白利用靶向結(jié)合切割目標(biāo)核酸的活性，同時附帶激活旁切活性（即非特異性切割DNA或RNA的酶切活性）。旁切活性能切割引入的核酸報告分子產(chǎn)生檢測信號，使CRISPR蛋白作為檢測體系的核心組件。論文總結(jié)了三種主要診斷體系的優(yōu)勢、局限以及適用范圍（表1）。

表1 CRISPR-Cas系統(tǒng)介導(dǎo)的分子診斷技術(shù)的優(yōu)勢與不足

CRISPR系統(tǒng)給分子診斷帶來的革新

（1）核酸檢測

論文具體論述了各種CRISPR核酸技術(shù)（圖1）、闡述了基于CRISPR-Cas9系統(tǒng)的特異靶向DNA序列介導(dǎo)的檢測技術(shù)和基于CRISPR-Cas12/Cas13系統(tǒng)介導(dǎo)的旁切活性的檢測技術(shù)的原理、檢測性能、臨床應(yīng)用情況。并且將針對特定病原體的CRISPR核酸檢測技術(shù)與PCR技術(shù)進(jìn)行比較，從檢測周期、檢測性能、檢測成本、應(yīng)用前景等方面對CRISPR技術(shù)進(jìn)行綜合評估。基于Cas12、Cas13的核酸檢測技術(shù)更是將檢測時間縮短到1h以內(nèi)，檢測成本最低可達(dá)到0.6美元/次。

同時，檢測體系的預(yù)擴(kuò)增策略和讀數(shù)方式在近幾年不斷得到改進(jìn)。擴(kuò)增方式從RPA轉(zhuǎn)變?yōu)樾矢摺⑻禺愋愿鼜?qiáng)的LAMP方法。讀數(shù)方式由單一的顯微鏡讀取熒光信號到測流層析試紙讀數(shù)、比色法讀數(shù)、智能反應(yīng)材料讀數(shù)等（圖2）。除此之外，微流控技術(shù)的引入也使多路復(fù)用的診斷策略得以實現(xiàn)。CARMEN-Cas13憑借微流控技術(shù)實現(xiàn)了在同一樣本中同時檢測169種病毒（圖3A）。這些新技術(shù)的引入使得CRIPSR技術(shù)的優(yōu)勢能在核酸診斷領(lǐng)域更好的發(fā)揮。

圖2 新興的讀數(shù)方法

（2）抗體診斷試驗

最近通過Cas9介導(dǎo)的自動組織技術(shù)（Cas9-mediated self-organization technology，PICASSO）開發(fā)了新的蛋白質(zhì)微陣列構(gòu)建方法。PICASSO將定制的多肽庫與dCas9蛋白融合表達(dá)，然后用單引導(dǎo)（Sg）RNA標(biāo)記融合蛋白。融合蛋白可以自動組裝在包含數(shù)千個目標(biāo)DNA的DNA微陣列上，以此構(gòu)建蛋白質(zhì)微陣列（圖3B）。這意味著特定的位置對應(yīng)于特定的DNA和融合蛋白，這使研究人員能夠快速識別臨床樣本中的抗體或大規(guī)模研究各種感興趣的蛋白質(zhì)。與傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)篩選工具相比，如噬菌體和核糖體展示，PICASSO可以實現(xiàn)蛋白質(zhì)表達(dá)水平標(biāo)準(zhǔn)化以及蛋白結(jié)合可視化，這可以提高文庫篩選的代表性并且避免擴(kuò)增偏差。

圖3 （A）CARMEN-Cas13微流控檢測方法原理圖； （B）PICASSO蛋白微陣列的組裝過程

（3）癌癥生物標(biāo)志物檢測

癌癥相關(guān)生物標(biāo)志物的檢測有助于癌癥患者的預(yù)后。CRISPR檢測技術(shù)可以檢測不同類型的癌癥生物標(biāo)志物。與傳統(tǒng)的檢測方法如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和酶聯(lián)免疫吸附試驗相比，CRISPR檢測技術(shù)不需要昂貴的儀器和經(jīng)驗豐富的操作員。例如，CRISPR技術(shù)可以檢測循環(huán)中的腫瘤DNA（ctDNA）和人體循環(huán)中的miRNA。Cas12a檢測系統(tǒng)可以在3小時內(nèi)檢測到EGFR858和EGFR790，檢測限為0.005%。而蛋白質(zhì)類型的生物標(biāo)志物的檢測需要引入適配子。依據(jù)蛋白質(zhì)的特殊結(jié)構(gòu)設(shè)計相應(yīng)適配子來靶向蛋白質(zhì)，并且適配子結(jié)合目標(biāo)蛋白后能被CRISPR系統(tǒng)檢測到，從而實現(xiàn)對蛋白質(zhì)的檢測。目前基于CRISPR的蛋白質(zhì)檢測方法有較高的靈敏度，但是由于適配子難以設(shè)計，該技術(shù)并沒有實現(xiàn)廣泛應(yīng)用。

（4）CRISPR技術(shù)的發(fā)展前景

論文最后論述了“實現(xiàn)CRISPR診斷技術(shù)的自動化和一體化，并且以CRISPR診斷技術(shù)為紐帶聯(lián)系病患和醫(yī)院構(gòu)建診療網(wǎng)絡(luò)”這一前瞻性策略（圖4）。目前通過優(yōu)化和整合CRISPR診斷體系中的樣品處理、預(yù)擴(kuò)增、CRISPR檢測和讀取過程，完全可能開發(fā)一體化CRIPSR檢測儀。而檢測自動化意味著降低檢測成本、加快檢測速度、統(tǒng)一診斷標(biāo)準(zhǔn)，這一舉措能夠擴(kuò)大CRISPR診斷技術(shù)固有的優(yōu)勢。診療網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建不僅有利于對陽性人員進(jìn)行及時處理，上傳的診斷數(shù)據(jù)還能夠指導(dǎo)CRIPSR檢測體系的進(jìn)一步優(yōu)化。

圖4 CRISPR診斷體系的前瞻性設(shè)想