結(jié)腸癌是世界上最常見的癌癥之一，其發(fā)病率和病死率較高，嚴(yán)重威脅著人類的健康。紅細(xì)胞分布寬度（red blood cell distribution width，RDW）是反映紅細(xì)胞（red blood cell，RBC）體積大小變異性的標(biāo)準(zhǔn)全血細(xì)胞計數(shù)測試參數(shù)，是對RBC異質(zhì)性檢測的客觀指標(biāo)。近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)RDW與癌癥總體死亡率關(guān)，因而在一定程度上可以預(yù)測癌癥患者的死亡風(fēng)險，能夠作為癌癥患者住院后短期死亡率的獨立預(yù)后指標(biāo)。因此，模擬血管內(nèi)部情況并研究RDW的特征對于結(jié)腸癌早期診斷及轉(zhuǎn)移過程的作用機(jī)制研究具有重要意義。毛細(xì)血管占據(jù)人體內(nèi)血管的90%以上，且紅細(xì)胞的直徑和毛細(xì)血管的直徑具有相同的數(shù)量級（微米級別），因此毛細(xì)血管流量對紅細(xì)胞流變特性具有顯著影響。

據(jù)麥姆斯咨詢報道，基于此，來自鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院的陳冰等設(shè)計了一種基于微流控的血管芯片，可用來模擬人體血管（尤其是毛細(xì)血管）內(nèi)部剪切力分布狀況，相關(guān)研究成果發(fā)表在期刊《微納電子技術(shù)》上。

首先，研究人員采用COMSOL軟件對微流控血管芯片進(jìn)行了功能驗證和尺寸優(yōu)化。COMSOL軟件仿真步驟如圖1所示。然后將L-Edit16軟件繪制好的芯片結(jié)構(gòu)導(dǎo)出為GDS的格式文件，并將芯片上的圖案轉(zhuǎn)移到微流控芯片母模上，具體步驟如下：首先利用DWL66激光直寫系統(tǒng)對鉻版上的光刻膠進(jìn)行曝光，隨后依次在顯影液、去鉻液以及去離子水中進(jìn)行浸泡，制作成掩模版，并通過光刻機(jī)將掩模版的圖案以光刻膠的形式轉(zhuǎn)移到硅片上得到母模。接下來制作聚二甲基硅氧烷（PDMS）芯片，首先將硅片母模進(jìn)行三甲基氯硅烷預(yù)處理，然后將PDMS預(yù)聚物和固化劑以10∶1的質(zhì)量比充分混合，將其倒在硅烷化的母模晶片上，在85℃的烘箱中固化2h。將固化后的PDMS層進(jìn)行打孔以形成入口/出口。PDMS的厚度約為3mm，適合固定插入的管子。通過氧等離子體處理將PDMS復(fù)制品永久粘合到蓋玻片上。實驗中使用的Ag/AgCL電極是通過將Ag絲放入KCL溶液中，以Pt為參比電極，在Ag絲面沉積涂覆AgCL制成的。將制作好的Ag/AgCL電極依次用異丙醇和去離子水進(jìn)行清洗，用針在進(jìn)樣管和出樣管側(cè)壁的位置各扎一個小孔，然后將清洗完成的Ag/AgCL電極從進(jìn)樣管和出樣管的扎孔位置穿入，另一端連接到電壓放大器（德國FEM TO公司）進(jìn)行信號測量。

圖1 COMSOL軟件仿真步驟

接著，研究人員基于人體血管的形態(tài)，充分考慮了血管內(nèi)部細(xì)胞流速和剪切力實際情況，構(gòu)建了基于微流控的血管芯片模型。為了模擬血管里的剪切力變化情況，設(shè)計了擠壓芯片和分叉芯片兩種血管芯片模型。擠壓芯片模型如圖2所示。該血管芯片包括一個入口和一個出口，其中入口用于通入細(xì)胞樣品溶液，出口用于收集流出的廢液。樣品中存在一些無關(guān)的雜質(zhì)，可能會導(dǎo)致微溝道堵塞等，從而影響實驗結(jié)果。因此通過在入口處添加過濾器來阻擋這些雜質(zhì)，過濾器的間隔為10μm。由于血管芯片的高度較低，出、入口的空腔跨度過大，會引起坍塌，因此在血管芯片出、入口設(shè)計了支柱。該擠壓血管芯片中除了擠壓區(qū)域的寬度（即俯視下溝道的寬度）和高度（三維中的厚度）不一樣，其他區(qū)域的尺寸是一樣的，從而可以用于研究擠壓對紅細(xì)胞的影響。該模型的微流控血管芯片擠壓寬度為4、6、8、10、12和15μm，擠壓次數(shù)為300、400、500、600、800、1000和1500。不同的擠壓寬度和擠壓次數(shù)會使剪切力有所不同，通過設(shè)置不同的擠壓寬度和擠壓次數(shù)來研究剪切力對RDW和紅細(xì)胞變形性的影響。

圖2 擠壓芯片模型

分叉芯片模型如圖3所示，該血管芯片包括一個入口和一個出口，其中入口用于通入樣品溶液，出口用于收集流出的廢液。該分叉芯片同樣設(shè)計了過濾器和支柱。此外，研究人員設(shè)計了分叉次數(shù)為8、16、32、64和128的微流控血管芯片來進(jìn)行實驗，研究分叉結(jié)構(gòu)以及分叉次數(shù)對RDW和紅細(xì)胞變形性的影響。

圖3 分叉芯片模型

隨后，研究人員探索了微流控芯片擠壓寬度對RDW-CC和紅細(xì)胞變形性的影響。實驗中采用的微流控芯片擠壓寬度分別為4、6、10和15μm，對照組的擠壓寬度為20μm。微流控芯片的擠壓次數(shù)為500次，實驗條件完全一致，將樣品瓶和恒壓泵通過軟管連接起來。微流控芯片入口先通入PBS排出芯片里的氣泡，然后通入配置好的紅細(xì)胞溶液。實驗中，先將恒壓泵的出口壓力設(shè)置為0.002MPa，等待鋼針端口緩慢地流出液體時，再將鋼針插入微流控芯片的入口，然后將0.1MPa作為正負(fù)壓恒壓泵的出口壓力，采用放大器對細(xì)胞產(chǎn)生的電信號進(jìn)行采集并放大。然后利用NI6363采集卡進(jìn)行A/D轉(zhuǎn)換，最后用LabVIEW軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)顯示。實驗結(jié)束后，把采集到的每種尺寸的電信號用Matlab程序進(jìn)行處理。實驗結(jié)果如圖4所示，擠壓次數(shù)為500時，擠壓寬度由15μm變成4μm，RDW-CC值升高了0.0763，且紅細(xì)胞的傳輸時間增加1.47ms，即擠壓寬度越窄，RDW-CC值越大，紅細(xì)胞的傳輸時間越長。

圖4不同擠壓寬度的紅細(xì)胞密度圖和傳輸時間

為了驗證微流控芯片擠壓次數(shù)對RDW-CC值和紅細(xì)胞變形性的影響，實驗分別設(shè)置了500、800、1000和1500的芯片擠壓次數(shù)，擠壓寬度為15μm，實驗條件完全一樣。在同一擠壓寬度（15μm）下，當(dāng)擠壓次數(shù)由500次變成1500次時，即增加了1000次時，RDW-CC值升高了0.0981，紅細(xì)胞的傳輸時間增加了1.02ms，即擠壓次數(shù)越多，RDW-CC值越大，紅細(xì)胞的傳輸時間也越長，如圖5所示。

圖5不同擠壓次數(shù)的紅細(xì)胞密度圖和傳輸時間

最后，實驗還設(shè)計了分叉結(jié)構(gòu)用于研究剪切力對RDW-CC值和紅細(xì)胞變形性的影響，分叉次數(shù)依次為8、16、32、64和128。當(dāng)分叉次數(shù)由8次變成128次時，即增加16倍時，RDW-CC值升高了0.0415，紅細(xì)胞的傳輸時間增加1.2ms，即分叉次數(shù)越多，RDW-CC值越大，紅細(xì)胞的傳輸時間越長（圖6）。

圖6 不同分叉次數(shù)的紅細(xì)胞密度圖和傳輸時間

綜上所述，研究人員提出了采用一種基于微流控的血管芯片來模擬人體血管內(nèi)部剪切力分布狀況，并研究了RDW變化。仿真結(jié)果表明微流控芯片內(nèi)的流體分布符合預(yù)期。利用電脈沖的幅值和寬度對RBC的大小和可變形性進(jìn)行表征，結(jié)果發(fā)現(xiàn)擠壓寬度越窄、擠壓次數(shù)越多、剪切力越大，則RDW表征參數(shù)（RDW-CC）值越大、RBC的傳輸時間越長；當(dāng)分叉結(jié)構(gòu)中分叉次數(shù)越多、剪切力越大，則RDW-CC值越大、RBC的傳輸時間越長。該方法不僅可用于RDW-CC的研究，也可用于其他血管模型的構(gòu)建。

論文鏈接：

http://dx.doi.org/10.13250/j.cnki.wndz.2022.06.008

審核編輯 ：李倩