熒光壽命顯微成像(fluorescence lifetime imaging microscopy, FLIM)是一種用于研究和測量生物分子的熒光壽命的技術，因其可以用于無標記成像，具有快速響應時間，可通過高分辨率成像技術（如共聚焦顯微鏡或雙光子顯微鏡）結合使用等特點，近年來已經廣泛應用于生物學、醫學研究和生命科學等相關領域。那么，FLIM是如何實現如此強大的功能呢？

FLIM的首要任務就在于測量熒光壽命(fluorescence lifetime, FL)，待測物體被一束激光激發后，該物體吸收能量后，從基態躍遷到某一激發態上，再以輻射躍遷的形式發出熒光并回到基態。將激發光關閉后，分子的熒光強度也將隨時間逐漸下降。

假定一個無限窄的脈沖光（δ函數）激發n0個熒光分子到其激發態，處于激發態的分子將通過輻射或非輻射躍遷返回基態。假定兩種衰減躍遷速率分別為Γ和Knr，則激發態衰減速率可表示為：

其中n(t)表示時間ｔ時激發態分子的數目，由此可得到激發態物種的單指數衰減方程：

上式中衰減總速率的倒數τ＝(Γ＋Knr)-1即為熒光壽命。熒光強度正比于衰減的激發態分子數，因此可將上式改寫為:

該式中，I0即為分子受激發時的zui大光強。我們將該熒光強度下降至激發時的熒光zui大強度I0的1/e（約37％）所需要的時間，稱為熒光壽命。

圖1 熒光壽命曲線示意圖

對于測量熒光壽命的方式可大致分為以下兩種，頻域法與時域法。而時域法還可進一步分為門控法、條紋相機法與tcspc法（Time-Correlated Single photon counting, 時間相關單光子計數）。目前，應用zui為廣泛的是TCSPC法，其基本原理是在一個極短的時間窗口內精確測量單個光子的到達時間。當激光或其他光源激發樣品時，樣品會發射熒光光子。這些光子傳播到檢測器，其中每個光子的到達時間都被記錄下來。記錄到達時間的數據可以被用來創建熒光壽命的時間衰減曲線，該曲線描述了熒光光子的時間分布。通過分析這些時間分布，可以獲得關于樣品的信息，如熒光壽命、發光光譜和熒光量子產率。其基本原理是測量光子到達探測器的時間。當一個光子被探測到時，會觸發一個計數器，記錄光子到達的時間。通過多次測量并記錄光子到達的時間，可以生成光子到達時間的分布曲線，如圖2所示，從而獲得有關樣品的信息。

圖2TCSPC原理示意圖

TCSPC系統具有非常高的時間分辨率，通常在皮秒（ps）級別。這使得它能夠精確測量光子到達時間，即使在非常短的時間尺內也能實現準確的測量，且可以處理極低光子計數的數據。基于統計分析的TCSPC法避免了熒光強度的直接測量，因而信噪比較高，探測效率近乎理想。但由于通常需要多次重復掃描來為每個像素采集足夠多的光子用于擬合熒光壽命，成像時間通常會較長。因此，如何提高成像速度與測量精度成為了人們關注的重點。近些年來，隨著超快激光技術、高速高靈敏探測技術以及圖像處理技術等相關技術發展，為開發廉價、高性能、多功能的熒光壽命成像系統創造了條件。

圖3FLIM系統示意圖

上海昊量光電zui新推出了意大利FLIM LABS公司的熒光壽命成像FLIM入門套件系統，專門為追求單光子FLIM成像和熒光壽命光譜應用而設計，能為您帶來高性能、高性價比的FLIM解決方案。該套件包括熒光壽命成像FLIM數據采集卡tdc、光纖耦合皮秒脈沖激光器模塊、SPAD單光子探測器與熒光壽命成像FLIM軟件，并在您需要時提供恒比鑒相器模塊。

圖4 FLIM LABS的熒光壽命成像FLIM入門套件

FLIM數據采集卡TDC：

我們的緊湊型USB 供電數據采集卡專為熒光壽命成像和光譜測量而設計。其基于FPGA的可定制技術，尺寸101x139x28mm，重量輕（僅120克），總計26個I/O通道可分辨熒光壽命50ps，死區時間1.5 ns，計時精度（σ/√2）300ps，24 或 48 ps 時間 bin 分辨率，并能通過USB3.0與PC軟件直接連接，無需額外供電。

光纖耦合皮秒脈沖激光器模塊：

我們的激光器模塊可用波長有405、445、488、520、635 和 850 nm，譜寬±10nm，獨立模塊，無需連接電腦。脈沖持續時間低至50ps (FWHM)，單模光纖耦合（FC/PC），150mW脈沖峰值，功率80MHz 時平均 CW 功率為 1.5mW，提供外部和內部數字同步觸發。

SPAD單光子探測器：

我們的USB 供電光纖耦合單光子 SPAD 探測器專為時間分辨熒光壽命成像和光譜測量而設計。尺寸小（100x60x30mm）且重量輕（235g），可通過USB 供電，光譜響應范圍從370nm 到 900nm，7 cps 暗計數，抖動小于200ps。

熒光壽命成像FLIM軟件：

我們的FLIM Studio軟件旨在簡化熒光壽命光譜和成像實驗的數據采集、重建和分析。該環境提供了用戶友好的界面和任何用戶都可以使用的直觀工具。可以做到實時成像和熒光衰減直方圖數據重建，實時FLIM 相量圖分析，并人工智能驅動的相量圖分析技術，提供用于數據采集和重建的軟件API（Rust、C、C++、C#、Python、node.js、.NET），支持MATLAB、Python、HDF5、.SVG FLIM 相量和成像數據導出。

恒比鑒相器CFD：

我們的恒定分數鑒別器（CFD）結構緊湊，性能卓越。恒比鑒相器CFD允許用戶將模擬信號（例如，來自PMT的信號、脈沖激光源的同步信號等）轉換為數字信號。恒比鑒相器CFD模塊非常易于使用，可以與不同的顯微鏡或光譜設置相結合。單通道雙輸出模塊，區分正負輸入信號，支持上升時間<500ps，抖動<15ps，zui大重復頻率為140MHz，zui小輸入可檢測信號為+/- 100mV，zui大輸出信號：4V@50Ohm 。

審核編輯 黃宇