近年來(lái)，大量研究致力于開(kāi)發(fā)DNA甲基化檢測(cè)方法。檢測(cè)方法的進(jìn)步可以促進(jìn)DNA甲基化在臨床醫(yī)學(xué)和科學(xué)研究方面的應(yīng)用。微流控芯片能提供反應(yīng)所需的條件和環(huán)境，可以被視作載體。微流控芯片上的分子分析由于其便攜性、高通量、低成本和高效率的優(yōu)點(diǎn)而受到廣泛關(guān)注。近年來(lái)，科研人員開(kāi)發(fā)出多種新型微流控芯片用于DNA甲基化分析并顯示出明顯優(yōu)于傳統(tǒng)方法的優(yōu)勢(shì)。

近期，來(lái)自天津大學(xué)精密測(cè)試技術(shù)及儀器全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的研究人員在Nanotechnology and Precision Engineering期刊上發(fā)表題為“Advances in microfluidic-based DNA methylation analysis”的綜述性文章，討論了基于微流控技術(shù)的DNA甲基化檢測(cè)方法，并描述了近年來(lái)取得的巨大進(jìn)展。最后，研究人員總結(jié)了基于微流控技術(shù)的DNA甲基化分析方法的優(yōu)勢(shì)及其面臨的挑戰(zhàn)和前景。

DNA甲基化及其檢測(cè)

DNA分子是細(xì)胞中遺傳信息的載體分子之一，具有遺傳效應(yīng)的DNA分子被稱為基因。經(jīng)典的孟德?tīng)栠z傳定律能較好地解釋很多的遺傳學(xué)現(xiàn)象。然而，經(jīng)典的遺傳學(xué)理論并不完備，能影響生命活動(dòng)的遺傳因素眾多。隨著多年來(lái)大量研究的不斷深入，研究者們對(duì)遺傳學(xué)有了越來(lái)越豐富的認(rèn)知。

表觀遺傳學(xué)是遺傳學(xué)的一個(gè)分支，主要研究在原始DNA序列沒(méi)有改變的情況下發(fā)生的基因表達(dá)可遺傳的變異。大量的研究表明，表觀遺傳與發(fā)育、衰老、疾病等生命過(guò)程相關(guān)。共價(jià)組蛋白修飾和DNA甲基化是表觀遺傳現(xiàn)象中被關(guān)注最多的分支。表觀遺傳修飾對(duì)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、基因表達(dá)、DNA和蛋白質(zhì)相互作用、X染色體沉默和基因組印跡等方面均有著影響。

DNA甲基化作為表觀遺傳的現(xiàn)象之一，影響著遺傳物質(zhì)的表達(dá)。在真核細(xì)胞中，其一般發(fā)生在CpG二核苷酸的胞嘧啶上。CpG二核苷酸在蛋白質(zhì)編碼基因的啟動(dòng)子和第一外顯子中的分布相對(duì)廣泛，說(shuō)明這種分布并非隨機(jī)。CpG二核苷酸含量相對(duì)較高的區(qū)域稱為CpG島：大多數(shù)的蛋白質(zhì)編碼基因在啟動(dòng)子區(qū)域含有CpG島，且其甲基化程度通常與基因的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)呈負(fù)相關(guān)。DNA甲基化在不同細(xì)胞、組織或個(gè)體間有著一定程度的差異。圖1展示了一種基因表達(dá)調(diào)控的機(jī)制，涉及多種相互作用。DNMT蛋白可以主動(dòng)改變DNA的甲基化狀態(tài)，Tet蛋白也被發(fā)現(xiàn)對(duì)DNA甲基化具有調(diào)節(jié)作用。甲基化CpG可以通過(guò)甲基CpG結(jié)合域（MBD）蛋白來(lái)確定。結(jié)合后，組蛋白脫乙酰酶（HDAC）可以修飾到組蛋白尾部，從而去除乙?；ˋC）。在上述過(guò)程之后，染色質(zhì)被壓縮并且基因表達(dá)被抑制。甲基化修飾在染色質(zhì)狀態(tài)的調(diào)節(jié)中起著重要作用。



圖1 DNA甲基化對(duì)基因表達(dá)的影響

DNA甲基化（如抑癌基因啟動(dòng)子CpG島的高甲基化）被發(fā)現(xiàn)與癌癥有很強(qiáng)的關(guān)系。許多的DNA甲基化的變化被證明與某種癌癥的發(fā)生有著特異性的關(guān)聯(lián)，并且在早期就能被檢測(cè)到。一些研究證明了伴隨癌癥發(fā)生的基因組整體甲基化程度降低。而且不同種類的癌癥有著各自特異性的甲基化修飾特征。該綜述也提到了能同時(shí)篩查多種癌癥的研究工作。因而胞嘧啶的甲基化修飾擁有著被用作癌癥篩查或診療的標(biāo)志物的極大的潛力。

一方面，由于缺乏大規(guī)模的驗(yàn)證和比較，DNA甲基化作為臨床醫(yī)學(xué)中疾病診療的依據(jù)仍然受到限制。另一方面，DNA甲基化在空間上的和時(shí)間上的異質(zhì)性對(duì)檢測(cè)手段提出了很高的要求。雖然已經(jīng)開(kāi)發(fā)出了不同的檢測(cè)方法，但是現(xiàn)有的方法仍然存在不足，這很大程度上限制了甲基化檢測(cè)被應(yīng)用于臨床醫(yī)療。因此，近些年來(lái)大量的研究聚焦在DNA甲基化的檢測(cè)方法上。

已經(jīng)開(kāi)發(fā)出多種極具潛力的方法來(lái)檢測(cè)甲基胞嘧啶，以滿足不同情況下的檢測(cè)要求，圖2列出了一個(gè)較為典型的DNA甲基化檢測(cè)流程。這些方法在靈敏度、成本、定量能力、分辨率、掃描范圍和響應(yīng)時(shí)間方面差異很大。而且，受制于工作流程的復(fù)雜性以及已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的與癌癥的特定關(guān)系不足等因素，DNA甲基化在臨床上的應(yīng)用并沒(méi)有達(dá)到預(yù)期。因此，DNA甲基化檢測(cè)手段是一個(gè)關(guān)鍵因素。很多的研究聚焦在開(kāi)發(fā)更為簡(jiǎn)便高效、低成本、高通量、高靈敏度的檢測(cè)方法上。

圖2 典型DNA甲基化分析的工作流程

基于微流控芯片的檢測(cè)方法

DNA甲基化分析在臨床醫(yī)學(xué)和科學(xué)研究中的應(yīng)用沒(méi)有達(dá)到最初的預(yù)期，部分原因是分析方法的復(fù)雜性、成本、通量和效率。為了促進(jìn)對(duì)DNA甲基化的理解，研究人員做出了多方面的努力。已經(jīng)開(kāi)發(fā)并報(bào)道了新的方法，近年來(lái)，基于微流控技術(shù)的分析優(yōu)勢(shì)逐漸凸顯。微流控芯片方法被認(rèn)為是有前景的，有望促進(jìn)DNA甲基化分析的更多應(yīng)用。目前已有的方法主要集中在樣本前處理微流控芯片、產(chǎn)物檢測(cè)微流控芯片、片上實(shí)驗(yàn)室等幾個(gè)方面。微流控芯片可以被開(kāi)發(fā)用于樣本亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化、核酸提取、目標(biāo)細(xì)胞篩選富集。另外，在產(chǎn)物檢測(cè)方面，微流控芯片可以結(jié)合電泳、表面等離子體共振、特異性擴(kuò)增、數(shù)字式擴(kuò)增、免疫分析等檢測(cè)方法，可以實(shí)現(xiàn)高通量且低成本的檢測(cè)。一種在微流控芯片上進(jìn)行的數(shù)字式擴(kuò)增和檢測(cè)用于DNA甲基化分析的方法被認(rèn)為是極具應(yīng)用潛力的。研究人員已經(jīng)設(shè)計(jì)、制造并驗(yàn)證了微陣列芯片，以并行地對(duì)每個(gè)目標(biāo)分子進(jìn)行分析。含有不同甲基化DNA的樣品用亞硫酸氫鹽試劑處理并純化。制備后，將PCR混合物驅(qū)動(dòng)到微腔中，并通過(guò)油分散以產(chǎn)生均勻的反應(yīng)，從而可以數(shù)字詢問(wèn)甲基化狀態(tài)。根據(jù)高分辨率熔體（HRM）分析的原理，超甲基化模板在轉(zhuǎn)化和擴(kuò)增后將表現(xiàn)出更高的熔融溫度。甲基化狀態(tài)是通過(guò)詢問(wèn)熔化溫度來(lái)判斷的。超低檢測(cè)限已在該平臺(tái)上得到確認(rèn)，這說(shuō)明了基于數(shù)字熔化的DNA甲基化分析的優(yōu)勢(shì)。

通過(guò)微流控技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)高度集成的檢測(cè)。芯片實(shí)驗(yàn)室或微全分析系統(tǒng)具有多種優(yōu)點(diǎn)。可以在芯片實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)上以快速簡(jiǎn)單的方式進(jìn)行各種臨床或生化臨床測(cè)試。在芯片上進(jìn)行DNA甲基化分析的整個(gè)過(guò)程是一個(gè)非常有吸引力的前景。已經(jīng)有很多相關(guān)研究致力于開(kāi)發(fā)用于檢測(cè)DNA甲基化的微流控芯片。

基于微流控芯片實(shí)現(xiàn)樣本前處理

亞硫酸氫鹽可用于將未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而甲基化胞嘧啶不會(huì)受到影響。經(jīng)過(guò)亞硫酸氫鹽處理的甲基化胞嘧啶和非甲基化胞胞嘧啶在PCR擴(kuò)增或測(cè)序中表現(xiàn)不同。胞嘧啶的甲基化修飾可以通過(guò)對(duì)比亞硫酸氫鹽處理前后的序列來(lái)確定。然而，基于亞硫酸氫鹽的分析的局限性之一是亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的復(fù)雜性。此外，在處理過(guò)程中，樣品反復(fù)暴露在環(huán)境中并在容器之間轉(zhuǎn)移，這可能導(dǎo)致污染和樣品損失。亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化過(guò)程中引入的污染和樣品損失可能導(dǎo)致假陽(yáng)性（陰性）、有偏差的定量或擴(kuò)增抑制。為了解決這個(gè)問(wèn)題，微流控芯片可以作為亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的優(yōu)良載體。

MBD蛋白可以修飾到表面上以捕獲目標(biāo)分子，這很容易通過(guò)微流控技術(shù)實(shí)現(xiàn)。另外還可以從細(xì)胞篩選的角度促進(jìn)DNA甲基化分析。靶細(xì)胞的選擇和分離可以通過(guò)親和富集來(lái)實(shí)現(xiàn)，可用于下游甲基化分析。當(dāng)流體流過(guò)芯片時(shí)，目標(biāo)細(xì)胞被捕獲，從而實(shí)現(xiàn)富集。目標(biāo)細(xì)胞可以被圖案化在器件上的微結(jié)構(gòu)捕獲，因?yàn)樗鼈兣c其他細(xì)胞具有不同的尺寸。該研究豐富了微流控技術(shù)在DNA甲基化分析中的應(yīng)用，該設(shè)備與多個(gè)下游分析相匹配。需要進(jìn)一步探索其與不同分析方法的耦合。

基于微流控芯片實(shí)現(xiàn)數(shù)字式檢測(cè)

大多數(shù)方法的定量能力不足，也缺乏檢測(cè)稀有DNA甲基化修飾的能力。異常的DNA甲基化是癌變組織中常見(jiàn)的表觀遺傳改變。然而，異常甲基化在正常組織中也可能較少出現(xiàn)，這有可能被用作癌癥風(fēng)險(xiǎn)標(biāo)志物。局限性在于正常組織中稀有甲基化的檢測(cè)和精確定量可能超過(guò)傳統(tǒng)的定量PCR的能力。數(shù)字PCR（Digital PCR，dPCR）技術(shù)在1999年被Vogelstein和Kinzler提出，被認(rèn)為是第三代PCR技術(shù)。對(duì)于上述問(wèn)題，基于數(shù)字PCR的DNA甲基化檢測(cè)得到了極具競(jìng)爭(zhēng)力的結(jié)果，而絕大多數(shù)的數(shù)字PCR方法都是基于微流控技術(shù)實(shí)現(xiàn)的。DNA甲基化檢測(cè)被進(jìn)一步地開(kāi)發(fā)出了數(shù)字化的形式。稀有的甲基化等位基因可以被成功檢測(cè)到并實(shí)現(xiàn)絕對(duì)定量。這種方法的意義在于它擁有檢測(cè)到正常組織中的稀有的甲基化修飾的能力。如圖3所示，微流控芯片可以以不同的方法幫助形成大量相互獨(dú)立且穩(wěn)定的液滴，包括大量微腔、油水相互作用等方法，這是微流控芯片的優(yōu)勢(shì)所在。



圖3 基于數(shù)字熔解分析的DNA甲基化分析

基于微流控芯片實(shí)現(xiàn)“樣本進(jìn)-結(jié)果出”檢測(cè)

研究人員致力于開(kāi)發(fā)高度集成的檢測(cè)方法，微流控技術(shù)提供了一條途徑。具有多方面優(yōu)勢(shì)的芯片實(shí)驗(yàn)室或微全分析系統(tǒng)的檢測(cè)模式可以以快速和簡(jiǎn)單的方式在芯片實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)上進(jìn)行各種臨床或生化臨床測(cè)試。如圖4所示，這種檢測(cè)模式可以允許包括樣本預(yù)處理在內(nèi)的所有的檢測(cè)步驟都在芯片上執(zhí)行，無(wú)需過(guò)多的人為操作和干預(yù)。在芯片上進(jìn)行DNA甲基化分析的整個(gè)過(guò)程具有重要意義。盡管芯片可以實(shí)現(xiàn)“樣本輸入-結(jié)果輸出”檢測(cè)，但目前已有的方法只能實(shí)現(xiàn)單次處理一個(gè)樣本。

圖4 “樣本進(jìn)-結(jié)果出”DNA甲基化檢測(cè)微流控芯片

微流控芯片的優(yōu)勢(shì)

本文介紹并討論了基于微流控的DNA甲基化分析的最新進(jìn)展。近年來(lái)，DNA甲基化引起了人們?cè)絹?lái)越多的關(guān)注，微流控技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于DNA甲基化的一些研究中。許多傳統(tǒng)方法已經(jīng)在微流控芯片上實(shí)現(xiàn)。比較目前已報(bào)道的多種基于微流控芯片的DNA甲基化檢測(cè)可以發(fā)現(xiàn)一些值得關(guān)注的特點(diǎn)。微流控芯片作為DNA甲基化檢測(cè)的很好的載體，能較好地減少外部干擾，防止污染等因素對(duì)檢測(cè)結(jié)果造成影響。盡管基于數(shù)字PCR的DNA甲基化分析的復(fù)雜性較為明顯，但其高靈敏度是不可否認(rèn)的，因此嘗試開(kāi)發(fā)更為簡(jiǎn)便高效的方法是有意義的。不同微流控器件之間的差異性較大，具體表現(xiàn)在靈敏度、定量能力、成本、檢測(cè)限、響應(yīng)時(shí)間等方面，而且在用途上也表現(xiàn)出了多樣性，如用于樣本前處理的微流控器件、基于不同檢測(cè)原理的微流控器件、用于芯片實(shí)驗(yàn)室的微流控器件等。

圖5 DNA甲基化檢測(cè)方法

可以通過(guò)使用基于微流控的方法而不是傳統(tǒng)的方法來(lái)減少分析所需的時(shí)間。多項(xiàng)研究利用微流控技術(shù)實(shí)現(xiàn)了DNA甲基化的快速分析。其次，通過(guò)創(chuàng)建具有用于dPCR擴(kuò)增的多個(gè)腔室的微流控芯片，可以以非常高的精度和靈敏度來(lái)量化DNA甲基化異質(zhì)性。開(kāi)發(fā)了基于dPCR的多重DNA甲基化分析方法。第三，一些研究通過(guò)使用微流控芯片實(shí)現(xiàn)了靈敏的DNA甲基化分析，檢測(cè)極限極低。微流控技術(shù)使單細(xì)胞DNA甲基化分析成為可能。最后，在微流控芯片上可以實(shí)現(xiàn)DNA的高效富集?？傊?，微流控技術(shù)為傳統(tǒng)的DNA甲基化分析帶來(lái)了多方面的改進(jìn)。在未來(lái)，還有一些方面可以進(jìn)一步探索。首先，應(yīng)開(kāi)發(fā)具有多功能的微流控系統(tǒng)，以應(yīng)對(duì)不同的臨床情況和需求。其次，預(yù)計(jì)將在微流控芯片上實(shí)現(xiàn)更多種類的傳統(tǒng)技術(shù)，這可能產(chǎn)生與當(dāng)前方法相比具有競(jìng)爭(zhēng)力的結(jié)果。關(guān)鍵的芯片上步驟，包括但不限于基因組DNA提取、亞硫酸氫鹽處理、擴(kuò)增和檢測(cè)，需要優(yōu)化以提高基于微流控的方法的競(jìng)爭(zhēng)力。最后，開(kāi)發(fā)高集成度和高通量的微流控方法仍有待進(jìn)一步探索。在臨床診斷和治療領(lǐng)域，肯定需要改進(jìn)DNA甲基化分析方法。微流控技術(shù)提供了一種很有前途的方法，可以以靈敏、便攜、快速、低成本和高通量的方式進(jìn)行DNA甲基化分析。

論文鏈接： https://doi.org/10.1063/10.0023845



審核編輯：劉清