全基因組DNA甲基化圖譜在整個表觀基因組圖譜中具有重要意義。單細胞DNA甲基化組學研究為根據(jù)甲基化組學特征檢測和分析細胞亞群提供強大助力。然而，現(xiàn)有單細胞甲基化組學技術都是基于試管或孔板，難以擴展處理大量單細胞。

近日，來自美國弗吉尼亞理工大學（Virginia Tech）的Chang Lu教授團隊進行了基于液滴微流控的亞硫酸鹽測序，用于單細胞DNA甲基化組學高通量分析的相關研究。該研究展示了一個高通量的基于液滴的單細胞亞硫酸鹽測序平臺（Drop-BS），利用液滴微流控技術提供超高通量，可在兩天內(nèi)制備多達10000個單細胞亞硫酸鹽測序文庫。將該技術應用于混合細胞系、小鼠和人類腦組織圖譜分析，可揭示細胞類型的異質(zhì)性。Drop-BS為需要檢測大量細胞群的單細胞甲基化組學研究提供了一種有前景的解決方案。研究成果以“Droplet-based bisulfite sequencing for high-throughput profiling of single-cell DNA methylomes”為題發(fā)表在Nature Communications期刊上。

Drop-BS工作流程

Drop-BS工作流程主要涉及到五個主要步驟和三個微流控裝置。（1）scDNA封裝和破碎：使用液滴生成微流控裝置將單個細胞核和含有微球核酸酶（MNase）的裂解緩沖液封裝成液滴，用于單個細胞核裂解和基因組DNA片段化。（2）scDNA與單條形碼珠液滴配對和融合：液滴融合裝置的三個入口產(chǎn)生含有單條形碼珠和末端修復/連接試劑的液滴，兩個側(cè)入口用于scDNA液滴的再注入和間隔。（3）scDNA連接和條形碼：將融合的液滴收集到一個試管中并暴露在紫外線下。條形碼寡核苷酸因光可裂解連接體從條形碼珠中釋放出來，并通過液滴中的連接反應附加到片段gDNA上，完成scDNA條形碼編碼。條形碼完成后，液滴打破。(4）基于液滴的亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化：與在試管中進行大量轉(zhuǎn)化相比，在液滴中進行亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化可將文庫濃度提高9倍。使用亞硫酸鹽液滴裝置生成含有條形碼DNA和亞硫酸鹽的液滴。液滴經(jīng)孵育后進行亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化。然后破碎液滴，匯集DNA。（5）隨機引物和indexing PCR：進行基于隨機引物和indexing PCR的擴增，生成用于測序的i5/i7索引文庫。

圖1 測序文庫生成流程

圖2 Drop-BS操作示意圖

Drop-BS性能表征

接著，研究人員進行了物種混合實驗，以評估Drop-BS生成單細胞甲基組數(shù)據(jù)的純度。將GM12878細胞核（人細胞系）和小鼠腦細胞核以1:1比例混合，制備約1000個細胞的單細胞亞硫酸鹽測序文庫。經(jīng)過細胞相關條形碼的篩選，結(jié)果顯示純度大于90%，表明Drop-BS平臺有效限制了液滴間串擾，并產(chǎn)生了高純度單細胞數(shù)據(jù)集。

然后使用三種不同類型的細胞系以及這三種細胞系等量混合物制備了Drop-BS文庫。隨后，對混合細胞的甲基組數(shù)據(jù)進行UMAP和盧萬聚類分析，得到了三個聚類。結(jié)果顯示UMAP聚類是由于三種細胞類型的mCG水平不同，而不是由于每個細胞獨特讀數(shù)數(shù)量不同。然而，單個細胞中唯一讀數(shù)數(shù)量的不均衡造成聚類內(nèi)部的分散，當各種細胞類型相似時，可能會降低分辨率。Drop-BS數(shù)據(jù)所反映的每種細胞類型的平均全局mCG水平與之前通過批量檢測報告的值相似。聚類合并單細胞數(shù)據(jù)與單獨分析細胞系的合并單細胞數(shù)據(jù)和以前發(fā)表的細胞系甲基組學數(shù)據(jù)具有高相關性。

圖3 利用Drop-BS識別包含三種細胞系混合樣本中的各細胞類型

利用Drop-BS進行腦樣本分析

將Drop-BS技術用于研究小鼠和人類前額葉皮層（PFC）樣本。研究表明，小鼠和人類前額葉皮層的CG和CH甲基化水平與之前發(fā)表的數(shù)據(jù)相當，小鼠和人類PFCs的mCG/CG平均值分別為71.73%和76.12%，mCH/CH平均值分別為1.85%和2.71%，大腦樣本中的mCH含量較高，此外，TSS附近有明顯低甲基化區(qū)域，整個基因組的甲基化水平高于相鄰基因間區(qū)域。根據(jù)單細胞在全基因組100 kb箱上CH甲基化水平，進一步對單細胞甲基組進行盧萬聚類分析。在小鼠PFC樣本中，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元特異性CG-DMRs是指特定細胞類型中CG甲基化水平低于其他細胞類型的區(qū)域。接著對人腦樣本進行分析。顯示對Drop-BS大腦數(shù)據(jù)進行UMAP聚類得到一致結(jié)果。根據(jù)合并聚類的人類神經(jīng)元特異性CG-DMRs6的CG甲基化分數(shù)，確定聚類3為抑制性神經(jīng)元，聚類1、4、5為興奮性神經(jīng)元，聚類2、6、7為非神經(jīng)元細胞。在全基因組水平和集群的各種功能元件中檢測mCH水平，發(fā)現(xiàn)全基因組水平和功能元件上都觀察到集群的mCH水平差異。

圖4 基于腦組織中單細胞CH甲基化的Drop-BS用于區(qū)分細胞類型

綜上所述，研究人員開發(fā)的基于液滴的單細胞亞硫酸鹽測序平臺（Drop-BS）利用液滴微流控技術優(yōu)勢，其液滴生成和融合速度可達每秒數(shù)百至數(shù)千，數(shù)百萬個液滴可在數(shù)小時內(nèi)處理完畢。這種速度在兩天內(nèi)可生成多達10000個單細胞亞硫酸鹽測序文庫。并且，基于液滴的亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化率高達99.0%。此外，Drop-BS數(shù)據(jù)在細胞系（n=5741個細胞）和腦樣本（n=3936個細胞）中的平均映射效率分別為72%和63%。總之，該技術為利用組織樣本研究單細胞甲基化組學提供了一種高通量、可擴展的方法。

審核編輯：劉清