鎖相放大器用于生物樣品雙通道和多儀器模式SRS顯微技術的研究

一．簡介

拉曼散射光譜為生物分子的特異性檢測和分析提供了化學鍵的固有振動指紋。那么什么是受激拉曼散射顯微鏡？受激拉曼散射(SRS)顯微技術是一種相對較新的顯微技術，是一種相干拉曼散射過程，允許使用光譜和空間信息進行化學成像[18]，由于相干受激發射過程[1]能產生約103-105倍的增強拉曼信號，可以實現高達視頻速率(約25幀/s)[2]的高速成像。SRS顯微鏡繼承了自發拉曼光譜的優點, 是一種能夠快速開發、label-free的成像技術，同時具有高靈敏度和化學特異性[3-6], 在許多生物醫學研究的分支顯示出應用潛力,包括細胞生物學、脂質代謝、微生物學、腫瘤檢測、蛋白質錯誤折疊和制藥[7-11]。特別的是，SRS在對新鮮手術組織和術中診斷的快速組織病理學方面表現出色，與傳統的H&E染色幾乎完全一致[12,13]。此外，SRS能夠根據每個物種的光譜信息，對多種組分的混合物進行定量化學分析[6,7,14]。

盡管在之前的研究[17]中已經研究了痛風中MSU的自發拉曼光譜，但微弱的信號強度阻礙了其用于快速組織學的應用。因此，復旦大學附屬華山醫院華英匯教授 和復旦大學物理學系季敏標教授團隊將受激拉曼散射顯微技術用于人體痛風組織病理成像[15]。研究人員應用SRS和二次諧波（SHG）顯微鏡同時表征了晶型和非晶型MSU。在普通光鏡下，MSU晶體呈典型的針狀。這些晶體在拉曼峰630 cm-1的SRS上很容易成像，當SRS頻率稍微偏離振動共振時，表現出了高化學特異性的非共振行為，SRS信號消失。已知SHG對非中心對稱結構敏感，包括MSU晶體和[17]組織中的膠原纖維。然而，由于拉曼極化率張量和二階光學磁化率對晶體對稱性[16]的依賴，研究者們發現線偏振光光束在晶體取向上傾向于產生SRS和SHG的強各向異性信號。因此，研究者們對泵浦光束和斯托克斯光束都應用了圓偏振，以消除MSU晶體和膠原纖維的定向效應。

Moku:Pro 的鎖相放大器 (LIA) 為受激拉曼散射 (SRS) 顯微鏡實驗中的自外差信號檢測提供了一種直觀、精確且穩健的解決方案。高質量的 LIA 是 SRS 顯微鏡實驗中具有調制傳輸檢測方案的關鍵硬件組件。在此更新的案例研究中，我們提供了有關雙 LIA 應用程序的更多詳細信息和描述。

由于SRS 是一種相干拉曼散射過程，允許使用光譜和空間信息進行化學成像[18]。它使用兩個同步脈沖激光器，即泵浦和斯托克斯（圖 1）相干地激發分子的振動。當入射到樣品上的兩束激光的頻率差與目標分子的振動頻率相匹配時，就會發生 SRS 過程。振動激發的結果是泵浦光束將失去光子，而斯托克斯光束將獲得光子。當檢測到泵浦光束的損失時，這稱為受激拉曼損失 (SRL) 檢測。強度損失 ΔI?/I? 通常約為 10 -7 -10 -4，遠小于典型的激光強度波動。為了克服這一挑戰，需要一種高頻調制和相敏檢測方案來從嘈雜的背景中提取 SRS 信號[19]。在 SRL 檢測方案中，斯托克斯光束以固定頻率調制，由此產生的調制傳輸到泵浦光束由 LIA 檢測。

二．實驗裝置

使用的激光系統能夠輸出兩個 80 MHz 的激光脈沖序列：斯托克斯光束在 1030 nm，泵浦光束在 790 nm。激光輸出也用于同步調制：80 MHz 參考被發送到分頻器以生成 20 MHz TTL 輸出。這些 20 MHz 輸出被使用兩次：一次作為電光調制器調制斯托克斯光束的驅動頻率，另一次作為外部鎖相環的 LIA 輸入通道 2（B 中）的參考。泵浦光束由硅光電二極管檢測，然后被發送到 LIA 的輸入通道 1（In A）。來自輸出通道 1（Out A）的信號被發送到數據采集卡以進行圖像采集。來自輸出通道 2 (Out B) 的信號被最小化（通過調整相移）。

2.1 單通道鎖相放大器配置

圖 2 演示了用于 SRS 顯微鏡實驗的 LIA 的初始設置。在初始設置時，必須重新獲取鎖相環。輸入均配置為 AC：50 歐姆。通過調整相位度數優化相移 (Df)，直到 Out A 最大化（正值）并且 Out B 最小化（接近零）。探針A顯示對應于 DMSO 最高信號峰 (2913 cm-1 ) 的 SRS 信號，并最大化輸出 A 的 103.3 mV。探針B表示正交輸出，最小化為零。一旦 LIA 針對校準溶劑進行了優化，樣品就可以進行成像了。

圖 3 是使用 Moku:Pro 鎖相放大器拍攝的 HeLa 細胞圖像。顯示的圖像是從 SRS 圖像生成的，拉曼位移為 2930cm-1，對應于蛋白質峰。低通濾波器設置為 40 kHz，對應于 約4μs 的時間常數。可以根據SRS信號大小增加或減少增益。

2.2 雙通道成像

Moku:Pro 的 LIA 也適用于實時雙色 SRS 成像。這是通過在 SRS 成像中應用正交調制并檢測LIA的X和Y輸出來執行的。在這種情況下，斯托克斯調制有兩個部分：一個 20 MHz 脈沖序列生成SRS信號，另一個 20 MHz 脈沖序列具有90°相移，生成另一個針對不同拉曼波段的SRS信號[3]。由于90°相移，兩個通道（Out A和Out B）彼此正交，可以同時獲取兩個SRS圖像而不會受到干擾。

圖 4 是利用雙通道X&Y輸出同時在2930 cm -1和 2850 cm -1處生成兩個 SRS 圖像的代表性圖像。

2.3多儀器模式應用

在大多數 SRS 顯微鏡實驗中，由于激光器總帶寬的限制，光譜范圍被限制在大約 300 cm -1左右。繞過這一技術障礙的一種方法是使用可調諧激光器掃描波長。然而，波長調諧速度很慢，而且對于時間敏感的實驗（如活細胞成像）來說往往不夠。應對這一挑戰的另一種解決方案是引入第三束激光束來掃描不同的拉曼過渡區域。這種能力對于兩個光譜區域的同時成像特別有吸引力：一個在指紋區域（例如 約1600 cm-1用于酰胺振動）和一個在CH區域（例如 約2900 cm -1蛋白質）。在 SRL 成像方法中，實驗裝置由一個斯托克斯光束和兩個不同波長的泵浦光束組成。此設置的常用檢測方法需要單獨的檢測器和單獨的 LIA。然而，Moku:Pro 的多儀器模式允許部署多個LIA，因此可以在不需要任何額外硬件妥協的情況下實施第二個LIA。

圖 5 演示了LIA 的多儀器模式設置，用于同步 SRS 顯微鏡實驗。對于Slot 1，In 1是第一個光電二極管的檢測信號，In 2是參考信號，Out 1是發送到數據采集卡的信號，Out 3被丟棄。對于 Slot 2，In 3 是第二個光電二極管的檢測信號，In 2 再次作為參考，Out 2 是發送到數據采集卡的信號，Out 4 被丟棄。此配置僅使用 4 個 Moku 插槽中的 2 個。插槽 3 和 4 未分配，因此可用于進一步的 LIA 或任何其他 Moku 儀器。輸入全部配置為 AC：50 歐姆。每個 LIA 插槽（1 和 2）都遵循與單通道 LIA 配置相同的設置。

在三個激光器的情況下，Moku:Pro 的多儀器模式可以配置兩個鎖定放大器，將系統簡化為一個設備，而不會有任何妥協。這使得研究人員可以同時拍攝兩張波數差較大的 SRS 圖像，利用一個 Moku:Pro 來處理兩個光電二極管檢測器信號。

圖 6 是利用一個Moku:Pro處理兩個光電二極管檢測器信號同時拍攝兩個大波數差的 SRS 圖像的代表性圖像。

三．結論

Moku:Pro 的 LIA 為大量 SRS 顯微鏡實驗提供了出色的解決方案。在本文檔中，討論了典型的單通道 SRS 成像、雙通道成像和多儀器成像。用戶界面允許對提取低強度 SRS 信號進行直觀和強大的控制。重要的是 Moku:Pro 的多儀器工具功能允許在多儀器同用的緊湊型系統上進行復雜的成像實驗。