蛋白質是組成生物細胞、組織的重要成分，生物的所有生命活動都離不開蛋白質的參與。蛋白質是生命的物質基礎，是構成細胞的基本有機物，是生命活動的主要承擔者。生物材料中蛋白質含量的測定是生物學研究中最重要也是最基本的實驗操作之一，目前常見的測定方法有考馬斯亮藍法(Bradford法)、紫外吸收法、雙縮脲法（Biuret法）、Folin-酚試劑法（Lorry法）、二喹啉甲酸法（BCA法）和凱式定氮法（Kjedahl法）等。每種方法原理不同，操作不同，都有其優點和局限性。

本文介紹的是考馬斯亮藍法，即Bradford法測定蛋白質的相關內容，它是通過染色方法測定溶液中蛋白質濃度的方法，是目前迅速可靠且靈敏度最高的蛋白質測定方法之一。

實驗原理：

Bradford蛋白質測定法是根據蛋白質與染料結合的原理設計的。考馬斯亮藍染料（G-250）在酸性溶液中與蛋白質的堿性氨基酸和芳香族氨基酸殘基結合，使得染料的最大光吸收峰位置由原來的465nm變為595nm，溶液顏色也由原來的棕紅色變為藍色，反應迅速且穩定，形成的化合物顏色深淺在一定范圍內與蛋白質濃度成正比關系，因此可通過測定結合染色后溶液在595nm處的光吸收度值來計算溶液中蛋白質的含量。

通過分光光度計先測定已知濃度的標準蛋白溶液染色后在波長595nm的吸光度A595并繪制標準曲線，然后測定同樣染色后的待測蛋白溶液在波長595nm的吸光度值，根據標準曲線即可計算出待測蛋白質的濃度。

實驗器材：

分光光度計（例如點成DEN-600小型光度計）

渦旋混勻器

試管及試管架

塑料/玻璃比色皿

微量移液器

主要溶液/試劑：

標準蛋白質溶液：可用牛血清白蛋白（BSA）作為標準蛋白。配制成1.0mg/ml的標準蛋白質溶液，4℃存放。

考馬斯亮藍G250染料試劑：稱取100 mg考馬斯亮藍G250，溶于50mL的95%乙醇后加入120mL 85%的磷酸，最后加入去離子水將試劑稀釋到1L。

待測蛋白溶液

實驗操作：

制取不同濃度的標準蛋白溶液：可取普通潔凈的試管7支，1號管取放0.1mL去離子水作為空白組，2-6號用微量移液器分別加入1.0mg/mL的BSA溶液0.02、0.04、0.06、0.08、0.10mL，然后每管均用去離子水補充到0.1mL，另外7號試管取放待測蛋白溶液0.1mL，所有試管用渦旋混勻器充分混勻；

加入染色試劑：用移液器或者移液管向上述試管分別加入3.0mL考馬斯亮藍G250試劑，用渦旋混勻器輕輕快速混合均勻；

比色：考馬斯亮藍試劑與蛋白質結合速度快，2-5分鐘即可完成，1小時內保持穩定，故可以在溶液靜置5分鐘后在分光光度計上測定各試管溶液在波長595nm處的光吸收值A595；

比色時使用的比色皿最好選用玻璃或者塑料比色皿，不要使用石英或者硅膠比色皿，因為考馬斯亮藍染料容易結合附著于石英或硅膠材料上，不易洗去染色。

比色完成后及時用水清洗，再用40%乙醇潤洗，洗去顏色，最后再用水洗凈。

如果使用的是塑料比色皿，乙醇潤洗時間不宜過長，決不能在乙醇或者丙酮中長時間浸泡，因為那會導致塑料比色皿溶脹失真。

制作標準曲線：以標準蛋白溶液濃度（mg/mL）為橫坐標，吸光度值A595為縱坐標作圖，可進行直線擬合，即可得到一條標準曲線；

計算待測蛋白質濃度：將分光光度計測出的待測蛋白質溶液的光吸收度A595值，對照標準曲線即可算出待測蛋白質濃度。

點成DEN-600光度計， 是一款緊湊、便攜、可電池供電的光度計，可以方便地放置在生物安全柜、培養箱中，該設備可容納10mm光程的標準比色皿、普通圓底試管或離心管等。USB連接和DEN軟件可進行數據傳輸、數據處理和計算。600 nm波長光學系統設計可以進行如下測量：估算細胞總數（OD600）、濁度測量（McFarland單位）、蛋白質濃度測量（Bradford 蛋白質測定法）。分光光度計通常應用于這些領域，因此DEN-600可作為分光光度計的平價替代品。

審核編輯 黃昊宇