熒光檢測是當(dāng)下最靈敏的光譜檢測技術(shù)之一，通過對光源調(diào)頻可以選擇激發(fā)躍遷的初始狀態(tài)和終了狀態(tài)，因此可以解析分子的十分復(fù)雜的譜帶，與其他光譜法相比，其具有靈敏度高、適用性好等優(yōu)點。然而，光學(xué)元件的小型化和光學(xué)配置是小型化熒光檢測器發(fā)展的兩大挑戰(zhàn)。

據(jù)麥姆斯咨詢報道，近期，來自上海應(yīng)用技術(shù)大學(xué)的研究人員于《微納電子技術(shù)》期刊發(fā)表論文，設(shè)計并制備了搭載熒光修飾核酸探OMUpy2-probe的微芯片的兩種優(yōu)化結(jié)構(gòu)。第一種結(jié)構(gòu)應(yīng)用薄膜的光干涉效應(yīng)，通過濕法腐蝕法制備石英薄膜，腐蝕過程中采用Cr作為保護膜形成石英玻璃、石英薄膜和石英玻璃的三層結(jié)構(gòu)，減少了原聚二甲基硅氧烷（PDMS）層在波長400-500nm的背景熒光；第二種結(jié)構(gòu)利用核酸的內(nèi)容位點帶負(fù)電，通過電泳的方式對核酸進行濃縮，并將Au電極連接到200μm寬的流路的兩側(cè)，設(shè)置電極電壓為0.1V，進行電泳濃縮實驗。總之，該研究提出的兩種優(yōu)化結(jié)構(gòu)彌補了原芯片在光學(xué)實驗中和低濃度實驗條件下的缺陷。

PDMS層的改進

原芯片分為兩部分，分別為具有高透光率和易于加工的PDMS層組成的上部和具有優(yōu)異紫外光透射率的石英玻璃層組成的下部。PDMS材料可通過簡單的方法用于構(gòu)建各種模式的通道。然而，從迄今為止報道的實驗中發(fā)現(xiàn)，在絕大多數(shù)PDMS芯片中，PDMS層會顯示自發(fā)的高熒光，由于激發(fā)光的反射，熒光光譜的背景干擾會增強。

而石英具有獨特的光學(xué)特性，且石英玻璃耐高溫、熱膨脹系數(shù)極小、化學(xué)熱穩(wěn)定性好，因此，在該研究中，研究人員采用石英替代了原芯片使用的PDMS。但更替為石英無法完全抑制散射光反射，相反，石英玻璃可能因材質(zhì)會使光學(xué)均勻性不穩(wěn)定，并導(dǎo)致其熒光更加分散，從而使散射光再次激發(fā)，所以研究人員在制備過程中應(yīng)用了薄膜的光干涉效應(yīng)。具體來看，研究人員在由石英玻璃構(gòu)成的流路層上添加一層由石英玻璃構(gòu)成的薄膜，然后和下部的石英玻璃鍵合，構(gòu)成石英玻璃、石英薄膜與石英玻璃的三層結(jié)構(gòu)，如圖1所示。薄膜制備和芯片制備流程圖如圖2所示。

圖2 薄膜制備和石英芯片制備流程圖

在考慮了熒光檢測芯片原材料的優(yōu)化后，研究人員設(shè)計了一種電化學(xué)濃縮核酸的方法，以便在低濃度區(qū)域進行檢測。此外，研究人員采用了兩種電極使用方法：一種是電極從流路兩端接入；另一種是電極從流路側(cè)方接入。為了確認(rèn)芯片能否進行核酸濃縮，使用制備的石英芯片，采用第一種電極接入方法，在微溝道中插入鉑絲（Pt）作為體電極來確認(rèn)熒光標(biāo)記的RNA（濃度為1μmol/L）的電泳。體電極核酸濃縮示意圖如圖3所示。

圖3 體電極核酸濃縮示意圖

而第二種方法采用剝離工藝，以Cr/Al作為電極材料，制作了Cr/Al薄膜電極。電極從流路側(cè)方接入，Cr/Al薄膜電極的制備流程圖如圖4所示。因在后續(xù)實驗過程中出現(xiàn)了電極脫落的現(xiàn)象，研究人員將電極材料由Cr/Al改為Au，制備流程與圖4流程基本一致，實驗示意圖如圖5所示，將Au電極與微溝道相連接（圖5（a）），然后用Cu作為導(dǎo)電材料連接Au電極，使用折射率為1.516的顯微鏡浸油和倍數(shù)100的物鏡進行觀察（圖5（b））。

進一步實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)電極材質(zhì)為Au、電極電壓在0.82V以下時，才能使電極不發(fā)生脫落，樣品溶液不發(fā)生電解。當(dāng)電極電壓為0.1V、電泳時間達到80s時，核酸濃度比和熒光強度為最大值，核酸濃度比提高了約6.07倍，熒光強度提高了約2.28倍。綜上所述，所制備的微芯片既能改善熒光背景誤差，又能在低濃度樣品下濃縮核酸，提高熒光強度。

圖6 樣品濃度為1μmol/L、電極電壓為0.1V時不同電泳時間的熒光效果圖