代謝物是生化調控的最終產物，可以實時準確地表征細胞的生化表型。由于細胞的異質性和某些代謝物的快速周轉，傳統的檢測大量細胞的方法無法準確反映單個細胞的情況，因此對單個細胞內代謝物的檢測越來越有必要。

單細胞代謝組學可以直接獲得單個細胞的代謝物信息，從而深入了解單個細胞的生理行為與其化學成分之間的關系。對于分子生物學研究和實際臨床應用來說，需要在短時間內對大量的單個細胞進行分析。因此，迫切需要高通量單細胞分析方法。

基于此，中國科學院大連化物所許國旺研究團隊運用單細胞代謝組學開發了一種新型的非對稱蛇形通道微流控芯片，一次性能分析3000多個單細胞，可運用于哺乳動物腫瘤細胞酵母細胞分析。相關成果以“High-throughput single cell metabolomics and cellular heterogeneity exploration by inertial microfluidics coupled with pulsed electric field-induced electrospray ionization-high resolution mass spectrometry”為題，發表于Analytica chimica acta期刊。

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為了實現高通量分析，需要進行細胞分離和聚焦，以確保單個細胞逐個引入質譜儀。目前還沒有一種方法可以在一次實驗中分析數千個細胞，而分析大量的細胞對于獲得有生物學意義的數據是非常重要的。

因此，研究人員開發了一種新型的非對稱蛇形通道微流控芯片，結合脈沖電場誘導電噴霧電離-高分辨質譜（PEF-ESI-HRMS）方法，用于近生理條件下的高通量單細胞分析，一次實驗可分析3000多個單細胞。在腫瘤細胞中，大約有120種代謝物被注釋，并且根據單個細胞代謝譜成功區分了兩種不同的腫瘤細胞（MCF7和HepG2細胞）。

非對稱蛇形微流控芯片的設計

為了實現高通量分析，在MS分析之前加入細胞分離和聚焦系統是必不可少的。微流控中的慣性聚焦可以在不使用鞘液或其他外場的情況下實現細胞的精確橫向平衡位置控制和細胞間距的調節。使用這種無鞘細胞聚焦方法，細胞中的代謝物不會被過度稀釋，從而可以擴大代謝物的檢測范圍，是一種很有前途的單細胞大規模細胞儀的進樣方法。

研究人員設計了一種具有不對稱蛇形通道的微流控芯片，它由15個重復的S形單元和一個相連的直通道組成（圖1a）。入口區域的微通道被加寬，以減少細胞表面的法向應力和剪切應力。模擬測試結果表明，微流控芯片對哺乳動物癌細胞具有分散和聚焦作用。

圖1 非對稱蛇形微流控芯片的設計：（a）蛇形水道的幾何示意圖；（b）第8個大彎道和第9個小彎道斷面二次流分布及矢量；（c）4s后相同直徑細胞的流線。

PEF-ESI-HRMS芯片的配置和性能

PEF-ESI-HRMS芯片包含四個部分：用于輸送細胞懸浮液的注射泵、用于分散和聚焦細胞的不對稱蛇形通道微流控芯片、PEF-ESI源和Q Exactive HF質譜儀。為了保持細胞活力和完整性，將細胞懸浮在碳酸氫銨等滲溶液中。通過注射泵將細胞懸浮液注入微流控芯片，然后通過不對稱微通道分散和聚焦細胞。當有序的單細胞到達納米噴霧發射器的尖端，電源產生的高壓方波脈沖將細胞分裂。最后細胞內容物被立即釋放并被離子化，然后通過質譜儀進行分析，從而獲得單個活細胞中代謝物的信息。

為了評估PEF-ESI-HRMS芯片的性能，將兩種癌細胞系（MCF7和HepG2）的細胞懸液引入系統。如總離子色譜圖（TIC）所示（圖2a），當細胞懸浮液流動時，獲得了單個細胞的脈沖樣信號。m/z 184.0733處的峰是磷酸膽堿，這是一種主要存在于細胞質中的重要代謝物，該信號的出現代表細胞的破壞，因此被用作單細胞質譜的標記。

磷酸膽堿的EIC（圖2b）與TIC具有良好的一致性，表明脈沖電場誘導的ESI源具有實現細胞碎裂和代謝物電離的能力。從MCF7（圖2c）和HepG2（圖2d）兩種不同的單細胞代謝譜中，可以觀察到HepG2肝癌細胞中代謝物的總體相對豐度較高。

圖2 采用PEF-ESI-HRMS分析MCF7和HepG2細胞系組成的不同細胞懸液。

需要注意的是，高濃度細胞懸浮液中粒子間相互作用會限制聚焦程度。細胞懸液的流速和濃度是影響單細胞質譜的兩個重要因素。研究人員研究了不同的流速以優化分析通量并提高系統穩定性。綜合考慮微流控芯片接口所能承受的壓力和最大分析通量后，選擇1μL/min為合適流速。

為了適配這種相對較高的注入流速，在納米電噴霧發射器中施加幅度為5kV Vpp和頻率為200Hz的方波電壓。另外，以1μL/min優化細胞懸浮液的濃度，結果如圖3b所示。單位時間內單細胞MS信號的數量隨著細胞濃度的增加而增加，并且它們之間存在線性相關性。如圖3c所示，以1μL/min的流速和濃度為8 × 10?個細胞/mL的MCF7細胞懸浮液，最大通量可達到約80個細胞/min。與之前報道的方法相比，該方法得到的數據更加穩定。

圖3 HepG2和MCF7細胞懸液流速和細胞濃度對單細胞MS分析的影響。

提取每個脈沖峰最高點的質譜信息，用于進一步的數據處理和分析。使用基于PEF-ESI-HRMS芯片的技術，可以從單個細胞中檢測到900多個特征峰，從群體細胞的LC-MS分析結果獲得的精確質量和二級質譜，可以鑒定出120種代謝物。對這些代謝物按照其化學特性進行分類，包括大多數重要的功能性代謝物，如氨基酸、酰基肉堿、羧酸及其衍生物或類似物（圖3d）。

為了盡可能地保持細胞處于天然狀態，使用等滲鹽溶液作為萃取溶劑，所以檢測到的代謝物主要是水溶性好的極性代謝物。總的來說，基于PEF-ESI-HRMS芯片的質譜流式細胞儀不僅展示出高通量，而且對極性代謝物檢測的覆蓋率也很高。此外，測試了儀器系統的穩定性，連續運行約3小時，仍然可以獲得穩定的質譜信號，而不會堵塞微通道或納米噴霧發射器。

PEF-ESI-HRMS芯片在單個哺乳動物細胞高通量分析中的實際應用

使用超過3000個HepG2細胞和MCF7細胞進行單細胞代謝檢測分析，并使用每種類型的1000個細胞的質譜數據進行進一步分析，來證明這種高通量方法區分各種癌細胞的實用性。根據PCA圖可以很好地區分這兩種類型的細胞（圖4a）。

基于機器學習的t-SNE和UMAP算法被用于挖掘和可視化復雜的單細胞質譜數據。可以清楚地觀察到MCF7和HepG2細胞的分離，并揭示了兩種癌細胞顯著的代謝異質性。云雨圖為了識別區分這兩種癌細胞的潛在生物標志物并評估它們的性能，進行了ROC分析。

結果表明這些代謝物可以作為區分MCF7和HepG2細胞的生物標志物。然后研究人員使用無監督學習算法孤立森林來檢測同種細胞中的異常值，結果在1000個HepG2細胞中發現了32個潛在異常值（圖4c）。非異常值的HepG2細胞在PCA圖中得到了很好的聚類，進一步證明了該技術在分析大規模單細胞樣品時良好的穩定性。

總體而言，HepG2細胞異常細胞中的代謝物含量高于非異常細胞（圖4d）。同樣地，鑒定了1000個MCF7細胞中的61個潛在異常值，結果如圖4e所示。與能量代謝密切相關的幾種關鍵代謝物在異常MCF7細胞中的含量相對較高（圖4f）。基于以上結果，異質性細胞的概率約為5%，表明該技術具有探索細胞代謝異質性的潛力。

圖4 PEF-ESI-HRMS芯片在單個哺乳動物細胞高通量分析：（a）基于單個HepG2和MCF7細胞的前兩個主成分的PCA圖；（b）MCF7和HepG2單細胞中亮氨酸和肌酸相對含量的云雨圖云雨圖；（c）HepG2細胞中的異常值；（d）HepG2細胞的異常值和非異常值中γ -氨基丁酸和氨基丙酮相對含量的云雨圖；（e）MCF7細胞的異常值；（f）MCF7細胞異常值和非異常值纈氨酸和磷酸相對含量的修正云雨圖。

在單個酵母細胞代謝譜分析中的實際應用

為了證明該技術對有細胞壁的細胞也具有破壞能力，使用釀酒酵母作為模型細胞進行實驗。這類酵母細胞的細胞壁具有彈性結構，常規代謝組學會使用酶解法、研磨法和超聲波法破壞酵母細胞壁，但這些方法都不適合單酵母分析。有研究表明，脈沖電場可以破壞酵母細胞壁，因此研究人員使用方波高壓脈沖使細胞快速被電傳孔，釋放出代謝物并被電離。

從單個酵母細胞中獲得的鳥氨酸、肌氨酸和賴氨酸的TIC和EICs（圖5a和5b）。在正離子模式下從單個酵母細胞中檢測到40多種代謝物，說明了該方法在具有細胞壁的單細胞代謝組學中的潛在應用。

圖5 單個酵母細胞代謝譜分析：（a）分析單個酵母細胞的裝置示意圖；（b）單個酵母細胞中獲得鳥氨酸、肌氨酸和賴氨酸的TIC和EICs圖。

總之，研究人員建立了一種通用的基于PEF-ESI-HRMS芯片的方法，用于在接近生理條件下進行高通量單細胞代謝組學分析。PEF-ESI-HRMS芯片與慣性微流控裝置的新型組合在提供更高的分析通量和穩定的電噴霧方面具有顯著優勢，并保持高分析靈敏度。

1分鐘內可完成80個癌細胞的分析，從單個HepG2或MCF7細胞中提取900多個特征峰，初步鑒定出120個代謝物，通過這種高通量方法實現了對這兩種癌細胞系的區分。

此外，通過孤立森林算法進一步識別了同類細胞內的代謝異常值，說明該方法具有鑒別代謝異質性細胞的潛力。該方法具有良好的分析穩定性，可以在一次實驗中連續分析3000多個細胞。除此之外，PEF-ESI電離源還具有破碎有細胞壁的細胞如酵母的能力，并進行分析。

因此，該技術有望為新一代高通量質譜流式細胞儀提供靈感，并為大規模單細胞代謝組學分析發揮加速作用，以幫助生物科學和臨床研究。

審核編輯：劉清