新冠病毒（SARS-CoV-2）具有高度傳染性，目前的檢測均基于實時逆轉錄PCR檢測技術，雖然效率高，但其技術要求高且價格昂貴，不適合資源相對稀缺的地區大規模使用。

據麥姆斯咨詢報道，江蘇省原子醫學研究所謝敏浩教授課題組基于CRISPR/Cas12a，開發了一種穩健且高靈敏度的電化學發光（ECL）生物傳感器平臺，用于檢測SARS-CoV-2 RdRp（RNA依賴性RNA聚合酶，簡稱RdRP）基因。相關研究內容發表在Chemical Engineering Journal上。

為了構建該生物傳感器平臺，研究人員在ECL生物傳感器電極表面修飾DNA四面體結構，DNA四面體可以與DNA1形成DNA三鏈復合物，在核酸擴增反應的初始狀態下，引入兩個發夾DNA（H1和H2），在存在核酸外切酶III（Exo III）的情況下，可以同步切割、釋放H1a和H2a。只有當H1a和H2a同時存在時，才能形成H1a/H2a雙鏈，從而激活CRISPR/Cas12a的活性，并允許CRISPR/Cas12a切割DNA1（圖1B）。如果反應體系中不存在目標物質，則無法形成H1a/H2a雙鏈，也無法激活CRISPR/Cas12a的活性并切割DNA1。其中體系中的DNA1與電極表面的DNA四面體結合將引起ECL信號的變化，特別的是，該生物傳感器平臺可以在pH=10時“再生”（圖1A），使其能夠持續長期使用，從而準確監測待測核酸濃度。

圖1 基于CRISPR/Cas12a反式活性測定SARS-CoV-2 RdRp基因的pH誘導再生生物傳感器示意圖

為了進一步研究該傳感器平臺的特征，研究人員首先通過透射電子顯微鏡（TEM）對合成的Au-g-C?N?進行表征，觀察到金納米粒子的直徑約為17nm，且均勻分散在C?N?納米片的表面（圖2A），此外還通過紫外表征發現合成的Au-g-C?N?將會在360nm和520nm之間有特征峰（圖2B），介于AuNPs（520nm）和g-C?N?（360nm）特征峰之間，并通過能量色散X射線光譜儀（EDX）進行元素分析（圖2C、D），均表明Au-g-C?N?成功合成；通過聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）表征DNA四面體的成功合成（圖2E）。

圖2 Au-g-C?N?和DNA四面體的表征

在本研究中，發光信號最初來源于g-C?N?，其可能的發光機理如下：g-C?N?在外加電壓下獲得一個電子，并轉化為g-C?N?（1）；S?O?2?在外加電壓下獲得一個電子，并降低為SO?2?和SO??（2）；SO??和g-C?N??之間發生電子轉移，并且g-C?N??在激發態下變成g-C?N?*（3）；g-C?N?*的激發態完成了電子躍遷，并轉變為基態g-C?N?，同時在460nm處產生光（4）。

為進一步表征pH介導再生生物傳感器逐步修飾過程的電化學響應，研究人員采用了循環伏安法（CV）。裸玻碳（GCE）電極的CV曲線（曲線a）顯示了最大電流峰值。當Au-g-C?N?（曲線b）沉積在電極表面時，電流峰值顯著降低。當DNA四面體和6-巰基己醇（MCH）（曲線c）繼續在電極表面進行進一步修飾時，電流峰值繼續降低，表明不良導電物質吸附在電極表面，這與DNA四面體和MCH的絕緣性能一致。DNA1繼續通過四面體吸附在電極表面后，電流繼續減少（曲線d），導致電流峰值出現類似的減少。同時，通過圖3B所示的電化學阻抗譜（EIS）對pH介導再生生物傳感器的逐步構建過程進行了表征。電化學CV和EIS表征均證明成功合成了pH介導再生生物傳感器。研究人員發現60min為Exo III輔助擴增反應時間的最佳條件（圖3C），90min后三鏈核酸形成達到穩定(圖3D)。

圖3 使用循環伏安法和電化學阻抗譜法表征生物傳感器的構造

最終將構建的比率ECL生物傳感器在優化條件下用于檢測SARS-CoV-2 RdRp基因。圖4A描繪了ECL信號隨SARS-CoV-2 RdRp基因濃度增加的變化。發現ECL（620nm）/ECL（420nm）的變化值也與ECL（620nm）/ECL（420nm）呈線性關系（圖4B）：Y=6.466 × 10??X-0.034，R2=0.9950，其中Y是ECL（620nm）/ECL（420nm）的比值，X是RdRp基因的濃度，根據檢測極限（LOD）的計算公式：LOD=3σ/k，該生物傳感器的LOD為43.70aM。

圖4 不同靶標DNA濃度下ECL及ECL（620nm）/ECL（420nm）信號的變化

將修飾后的電極浸入含有1pM SARS-CoV-2 RdRp基因的PBS中，連續掃描10個循環。ECL信號在460nm（圖5A）的相對標準偏差（RSD）為1.7%，ECL信號穩定在620nm（圖5B）時RSD為2.5%，這些實驗結果均表明該生物傳感器具備優異的穩定性。最后，研究人員研究了構建的生物傳感平臺在不同pH值下的pH介導再生。研究發現，當生物傳感器在TAE緩沖液（pH=10.0）中培養時，形成三鏈DNA的生物傳感器可以在該pH值下使得DNA從電極表面解離而再生（圖5D）。

圖5 pH誘導的再生生物傳感器的穩定性和選擇性

總體來說，謝敏浩教授課題組提出的基于CRISPR/Cas12a的pH介導再生生物傳感器，其用于診斷SARS-CoV-2 RdRp基因的檢測靈敏度可達到43.70aM，具有臨床應用的潛力。

論文鏈接：

https://doi.org/10.1016/j.cej.2021.132472

審核編輯 ：李倩